Aggregierte Zellen und Zellen auf Microcarriern

Zellbiologische Forschung bei Hookipa Pharma

Die Kernzählung wurde erstmals 1951 von Sanford et al. beschrieben und von van Wezel modifiziert. bei diesem Verfahren werden die Zellen mit hypotonen Lösungen permeabilisiert und die Zellkerne mit einer Farbstofflösung, z. B. Kristallviolett, gefärbt und gezählt. Dies führt oft zu einer Überschätzung der Zellkerne, da Kerne nicht genau von Trümmern unterschieden werden können.

Um dieses Problem zu überwinden, bieten die Bildzytometer von ChemoMetec A/S eine Kernzählung mit Fluorophoren, die eine klare Unterscheidung zwischen Kernen und zellulären Trümmern ermöglicht und dadurch eine schnelle und zuverlässige Methode zur Erfassung von Zellkernen gewährleistet.

Ablösen von Verozellen von Microcarriern

Vero-Zellen sind verankerungsabhängige Zellen, die auf Microcarriern kultiviert werden können, um die Produktion auf Ausbeuten von mehreren Millionen Zellen pro Milliliter in Großfermentern zu skalieren. Die Überwachung von Microcarrier-Kulturen ist anspruchsvoll und zeitaufwändig, da die Zellen in einem mehrstufigen Prozess von den Trägern abgelöst werden müssen.

Unbehandelte Vero-Zellen erschienen als konfluente Zellschicht auf den Microcarriern. Bereits nach zwei Minuten Inkubationszeit wurde die Zellschicht aufgelöst. Das Reagenz A100 war nicht in der Lage, alle Aggregate aufzulösen, was sich in nicht lysierten Zellklumpen zwischen verbleibenden aggregierten Microcarriern nach einer Minute Inkubation bemerkbar machte.

Ergebnisse

HEK293-Zellen bilden Zellaggregate mit einem Durchmesser von bis zu 3 mm. Bei der Verwendung von automatisierten Zellzählern sind viele Algorithmen aufgrund des dreidimensionalen Erscheinungsbildes nicht in der Lage, die korrekte Anzahl der Zellen zu bestimmen, was zu ungenauen Ergebnissen führt. Die Lyse mit Reagenz A100 führte zu einer gleichmäßigen Verteilung der Kerne und der Algorithmus konnte die einzelnen Kerne unterscheiden und zählen.

Bild A zeigt ein Punktediagramm der Rohdaten von DAPI-Area gegen Intensität der gefärbten Zellen in Blau mit der Standard-Gating-Strategie. Für die automatisierte Bestimmung der Zellzahl wurden mehrere aufgenommene Bilder (eines davon in B dargestellt) verwendet. Bild C zeigt einzelne Zellkerne im Detail, sowie die Bildüberlagerung zur Hervorhebung einzelner Zellen.

Siehe Vollständigen Datensatz im PDF-Poster

Fazit

Der A100- und B-Assay wurde zum Zählen von Vero-Zellen verwendet, die auf Cytodex 1 Microcarriern gewachsen sind. Bereits nach zwei Minuten Inkubationszeit mit Reagenz A100 konnte die maximale Anzahl der Zellkerne detektiert und die Gesamtzellzahl bestimmt werden.

Darüber hinaus haben wir das gleiche Protokoll für hochaggregierte HEK293-Zellen getestet. Der A100- und B-Assay war in der Lage, die HEK293-Aggregate aufzulösen, was zu einer Einzelzellsuspension führte. Gefärbte Zellkerne bildeten eine gleichmäßige Verteilung, wodurch sich die Anzahl der gezählten Gesamtzellen im Vergleich zur Zählung ungefärbter Zellen verdoppelte.

Für uns bei Hookipa ist das Zählen der Zellkerne mit dem NucleoCounter® NC-3000™ eine präzise und schnelle Möglichkeit, die Gesamtzellzahl und Viabilität von hochaggregierten HEK293-Zellen und Vero-Zellen auf Microcarriern zu bestimmen.

Autoren

Philipp Andre und Andreas Aspöck.