Kryokonservierung der Zelltherapie - Bestimmung der Prozessparameter

Bei BioLife Solutions

Zellbasierte Therapien erfordern eine spezielle Handhabung, damit der Transport von der Produktionsstätte zum Patienten erfolgreich verläuft. Um logistische Flexibilität zu bieten, verwenden viele aktuelle Kommerzialisierungsmodelle ein gefrorenes Zellprodukt, das in der Klinik bereitgestellt, gelagert, dann aufgetaut und bei Bedarf dem Patienten infundiert werden kann.

Die Viabilität und Expansionsfähigkeit vieler Zelltypen nach dem Auftauen leidet jedoch dramatisch unter kryokonservierungsinduziertem Stress, der als verzögert einsetzender Zelltod (DOCD) bezeichnet wird. Daher wird davon ausgegangen, dass einige Zelltypen nicht kryokonserviert werden können und erfolgreiche kommerzielle Modelle auf Anlieferung und Anzucht frischer Zellen beruhen sollten.

Herausforderungen der Kryokonservierung

Die kritischen Schritte der Kryokonservierung überschneiden sich mit den Herstellungsprozessen unmittelbar vor und nach der Zellkultur. Daher werden die Effizienz und Wirksamkeit der endgültigen therapeutischen Dosis sowie der Herstellungsprozess direkt von den kritischen Prozessparametern der Kryokonservierung beeinflusst. Aus diesem Grund ist ein gründliches Verständnis der Auswirkungen der Kryokonservierung auf Zellen für eine erfolgreiche kommerzielle Herstellung von Zelltherapien unerlässlich.

In dieser Studie untersuchten wir den Einfluss einiger der bekanntesten und einiger der weniger bekannten kritischen Prozessparameter (CPPs) auf die Viabilität und Proliferation nach dem Auftauen in einem Jurkat-T-Zellmodell. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass neben der Berücksichtigung der Best Practices für die Biokonservierung bei der Formulierung von Kryomedien auch andere scheinbar unwichtige und irrelevante Prozessparameter, die im Allgemeinen vernachlässigt werden, einen signifikanten Einfluss auf die Viabilität und Proliferation nach dem Auftauen haben können.

Erfolgreiche Kryokonservierungsmethode 24 Stunden nach dem Auftauen nachweisbar

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl CryoStor CS5 als auch die selbst hergestellte Formulierung aus PLA, 10 % w/v HSA und 5 % v/v DMSO bei der Erhaltung der Viabilität und der Proliferationskapazität von Jurkat-T-Zellen unter Verwendung der Standard-CPPs ähnlich gut abschnitten.

Der CryoStor CS5 schien jedoch die Belastungen durch Verdünnung oder stochastische Keimbildung deutlich zu minimieren und so die Zellen vor Schwankungen der Kryokonservierungs-CPPs (oder nicht standardisierten CPPs) zu schützen, was zu einer verbesserten Zellzahl und Viabilität 24 Stunden nach dem Auftauen, sowie einer geringeren Variabilität der Ergebnisse führte.

Die Abbildung zeigt die Wiederherstellung der Viabilität und die Expansion von Jurkat-T-Zellen nach dem Auftauen, bewertet mit einem Membranintegritäts-Assay (dem Annexin-V-Assay). (* p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001, und **** p<0,0001). Rote Sternchen (*) beziehen sich auf den Vergleich mit den Ergebnissen der Standardmethoden. Fehlerbalken kennzeichnen SD. CS5: CryoStor® CS5; HB: Selbstbrauen.

Fazit

Die unmittelbare Analyse der Viabilität und Anzahl der Zellen nach dem Auftauen ist kein Hinweis auf einen erfolgreichen Kryokonservierungsprozess. Unerwünschte Wirkungen von nicht optimierten Kryomedien sind möglicherweise erst 24-48 Stunden nach dem Auftauen nachweisbar, was auf den durch die Kryokonservierung induzierten DOCD zurückzuführen ist.

Die Verwendung von optimierten Kryokonservierungsmedien kann dagegen vor DOCD schützen, was zu einer geringeren Variabilität und einer genaueren Abschätzung der Überlebensrate und Proliferation nach dem Auftauen führt.

Autoren

Alireza Abazari, Brian J. Hawkins und Aby J. Mathew.