Hämatopoetische Stammzellen (HSCs)

Effektive Bestimmung der Viabilität und Zellzahl für Stammzelltransplantationen

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind multipotente Zellen, die größtenteils aus Knochenmark gewonnen werden, aber auch in Nabelschnurblut und mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) vorkommen. HSCs waren die ersten Zellen, die als Stammzellen angesehen wurden, und dienen als Vorläuferzellen für Blut- und Immunzellen1. CD34 ist der Hauptmarker, der sie als multipotent und hämatopoetischen Ursprungs identifiziert.

Hämatopoetische Stamm- / Progenitorzellen (HSPCs) werden häufig für allogene oder autologe Stammzelltransplantationen zur Behandlung von Blut- oder Knochenkrebs wie Leukämie und Myelomen verwendet. Hier werden HSCs für die Zellersatztherapie verwendet, wobei diese direkt von einem HLA-kompatiblen gesunden Spender entnommen und einem Leukämiepatienten zugeführt werden, um die erkrankten Zellen zu ersetzen.

HSPCs werden auch isoliert und in reifere Zelltypen der Blutlinie differenziert, als Alternative zu vom Patienten stammenden Materialien zu finden, z. B. für Blutinfusionen und Thrombozytenisolate, die während der Operation oder anderer Arten von Behandlungen verwendet werden. Beim Banking von Nabelschnurblut werden HSPCs aus der Nabelschnur von Neugeborenen isoliert und für eine mögliche zukünftige Verwendung für diese Person oder Verwandte, oder als Ressource für die Erforschung der möglichen Differenzierung und Verwendung der HSP-Zellen für neue Behandlungsmethoden aufbewahrt.

Mit den Fortschritten des Genome Editing – ein bekanntes Beispiel ist das CRISPR-Cas9-System – werden hämatopoetische Stamm- / Progenitorzellen (HSPCs) zur Behandlung und Heilung genetischer Krankheiten wie Sichelzellenanämie2 und insbesondere zur zellbasierten Immuntherapie unter Verwendung von B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen zur Erzeugung von chimären Antigenrezeptoren (CARs) zur Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzt.

Für viele Anwendungen, bei denen HSP-Zellen zum Einsatz kommen, müssen die Zellen isoliert werden und in einem multipotenten Zustand gehalten werden, damit sie sich vermehren können, ohne dass es zu einer spontanen Differenzierung kommt. Die weitere Differenzierung zu reifen Blutzellen oder eine andere anschließende Verarbeitung bzw. Manipulation der Zellen kann nach einer Vielzahl von Verfahren erfolgen.

Bei allen Verfaharen sind die Quantifizierung der Ausgangs- oder manipulierten Zellpopulation sowie die Identifizierung ihrer genetischen Marker und ihres Potenzzustands entscheidend, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen, Behandlungspotentiale zu validieren und therapeutische Ergebnisse  zu prognostizieren.

Herausforderungen bei der Zählung und Viabilität von HSCs

Knochenmark- und Vollblutproben enthalten rote Blutkörperchen (RBCs), Blutplättchen und PBMCs, eine Gruppe von Zellen, die Leukozyten, mesenchymale Stammzellen (MSCs) und HSCs (ausschließlich Knochenmark und peripheres Blut) umfasst. Die Bestimmung der Zellzahl und der Viabilität von frisch isolierten PBMCs ist eine Herausforderung, da die Probe immer noch RBCs enthält, und automatisierte Zellzähler, die auf Hellfeldmikroskopie basieren, nur begrenzt in der Lage sind, PBMCs von RBCs zu unterscheiden.

Lösungen für den Umgang mit HSCs

Um die Viabilität der gesamten Zellpopulation aus Nabelschnur- oder Knochenmarksproben zu quantifizieren und zu messen, zählt der NucleoCounter® NC-200™ nur PBMCs und schließt RBCs und Blutplättchen aus, da diese nur schwach gefärbt sind. Für die Untersuchung von Vollblutproben mit einer sehr hohen Konzentration an roten Blutkörperchen bietet der NucleoCounter® das „Viabilitäts- und Zellzahl-Blut-Assay“.

Durch die Verwendung einer Lyselösung werden die RBCs lysiert, um den Quenching-Effekt des Hämoglobins zu minimieren und eine robuste Färbung der PBMCs mit Acridinorange (AO) und DAPI zum Nachweis der gesamten bzw. toten Zellen zu gewährleisten. Aufgrund des Fehlens von Zellkernen und der dadurch schwachen Färbung werden Blutplättchen nicht erkannt. Mit der inkludierten NucleoView™ Software kann der Anwender überprüfen, ob alle Zellen korrekt gezählt wurden.

Wenn Sie eine vollständige Analyse von Zellmarkern sowie Zähl- und Viabilitätsdaten benötigen, verfügt der ® NC-3000™ über einen flexiblen Färbeassay, FlexiCyte™, der es Ihnen ermöglicht, bis zu zwei verschiedene Proben gleichzeitig mit mehreren Markern für benutzerdefinierte Programme zu färben und anpassbare Analyseeinstellungen vor und nach der Datenerfassung bietet.

Verweise

  1. JE Till and EA McCulloch: A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res. 1961; 14, 213–222.
  2. MA DeWitt, W Magis, NL Bray et al.: Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Transl Med. 2016; 8(360):360ra134.

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