Induzierte Pluripotente Stammzellen (iPSCs)

Präzise Zellzählung für Erfolg in der Regenerativen Medizin

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind eine Form von pluripotenten Stammzellen, die aus somatischen Zellen gewonnen werden. Dieser Zelltyp, der 2006 (Maus-iPSCs1) und 2007 (humane iPSCs2) im Labor von Shinya Yamanaka entwickelt wurde, hat die Arbeit mit pluripotenten Stammzellen revolutioniert, da sie dem Forscher erlauben, mit Stammzellen unterschiedlicher genetischer Krankheitshintergründe zu experimentieren. Darüber hinaus wurde vor der Einführung von iPSCs die Stammzellforschung an embryonalen Stammzellen (ESCs) durchgeführt, die aus menschlichem embryonalem Gewebe stammen. Die Verwendung von ESCs birgt ethische Bedenken hinsichtlich der Gewinnung und Kultur der Zellen und ist daher in vielen Ländern illegal oder eingeschränkt. Mit der Einführung von iPSCs konnten die meisten dieser ethischen Bedenken bei der Arbeit mit embryonalen Zellen überwunden werden. Als Ergebnis wurden iPSCs von Wissenschaftlern weltweit anerkannt.

Erzeugung, Kultur und Differenzierung von iPSCs

Neue Generationen von iPSCs werden kontinuierlich durch Überexpression der vier „Yamanaka-Faktoren“, d.h. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc in somatischen Zellen erzeugt, wodurch diese zu iPSCs werden. Dies ermöglicht die Erforschung des Differenzierungspotenzials bei Vorliegen unterschiedlicher genotypischer Hintergründe. Die Erforschung der Beziehung zwischen dem genetischen Ursprung und der phänotypischen Präsentation gibt Aufschluss über das Fortschreiten von Krankheiten und eine mögliche medikamentöse Behandlung.

Traditionell werden iPSCs auf Feeder-Zellen mit bovinem serumhaltigem Medium in einer 2D-Situation kultiviert. In dem Bestreben, eine kontrollierte Stammzellnische zu schaffen, haben sich die Kultursettings hin zu kontinuierlich eingeschränkten Bedingungen entwickelt, bei denen alle Komponenten serumfrei oder sogar xenofrei sind, und mit verschiedenen Kunststoffbeschichtungen anstelle von Zellen, an die man sich in der Kulturschale anlagern kann. Eingeschränkte Umweltbedingungen verbessern die Erhaltungsbedingungen für die Stammzellnische und fördern eine erfolgreiche, gezielte Differenzierung in Richtung der gewünschten Vorläufer- oder reifen Zelltypen: Durch die Wachstumsfaktoren und Inhibitoren besteht eine bessere Kontrolle der vorteilhaften Zell-zu-Zell-Signalisierung, die die Art der gerichteten Differenzierung bewirkt, an der Sie interessiert sind.

Jüngste Entwicklungen haben dazu geführt, dass sich die Kultivierung von Stammzellen von traditionellen 2D-Methoden zu physiologisch relevanteren 3D-Methoden wie Sphäroid- und Organoidkulturen verlagert hat, die eine angemessene Zell-zu-Zell-Signalübertragung und Interaktionen während des Zellwachstums und der Differenzierung ermöglichen. Diese 3D-Strukturen sind für die Arzneimittelforschung und die regenerative Medizin sehr vielversprechend, da sie es den Forschern ermöglichen, besser zu simulieren, wie sich ihre Behandlungen auf Gewebe in einer physiologisch relevanten Wachstumsumgebung (d. h. in der Stammzellnische) auswirken, anstatt nur in isolierten Zellschichten.

Im Vordergrund stehen dabei die von Toshiro Sato und Hans Clevers3 entwickelten intestinalen Organoide, die für das Wirkstoffscreening eingesetzt werden und bessere Behandlungsmöglichkeiten für Mukoviszidosepatienten ermöglichen4. Gehirnorganoide wurden zunächst von Madeline Lancaster5 eingeführt, bei denen iPS-Zellen in verschiedene Zelltypen und Bereiche des Gehirns differenziert werden, um komplexe Krankheitsmodellierungen, z. B. von Mikrozephalie, und Arzneimitteltests zu ermöglichen.

Was ist die Herausforderung?

Neben den Kulturmedien, den Oberflächenbeschichtungen und dem Pluripotenzniveau der Zellen, mit denen Sie arbeiten, ist die Zelldichte der vierte wichtige Faktor für den experimentellen Erfolg. Die interzelluläre Signalübertragung ist schwer zu kontrollieren und zu manipulieren, aber das Aussäen von Zellen in der richtigen Konzentration kann erheblich dazu beitragen, die gewünschte gerichtete Differenzierung zu erreichen. So haben z.B. Differenzierungsprogramme in Richtung mesodermer und endodermer Zelltypen, z.B. Herzzellen, gezeigt, dass niedrige Zelldichten die Anteile der interessierenden Zellen positiv beeinflussen 6,7. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass niedrige Zelldichten niedrigere Zytokinkonzentrationen bedeuten, um den gleichen Effekt zu erzielen, was letztendlich Kosten für Ihren Gewebekulturschritt spart.

Umgekehrt erfordern neurale Differenzierungsprogramme oft hohe Zelldichten, da die Zell-zu-Zell-Signalübertragung unverzichtbar ist und die Zelldichte zu Versuchsbeginn das Verhältnis von z. B. Zentralnervensystem- und Neuralleisten-Nachkommenschaft bestimmt 8,9.

Erhaltungskulturen von iPSCs werden in der Regel durchgeführt, indem dichte Kulturen als mittelgroße Aggregate (Klumpen) von Zellen passagiert werden, anstatt sie vor der Replikation in einzelne Zellen zu dissoziieren. Dadurch wird sichergestellt, dass die iPSC-Nische während der Passage nicht zu sehr gestört wird.

Lösungen für den Umgang mit iPSCs

Bei der Initiierung von Differenzierungsprogrammen an pluripotenten iPSC-Kulturen ist das Zählen der Zellen für die Selektion mühsam und etwas ungenau: Es ist zeitaufwendig und kann schwierig sein, die Zellen vollständig aus der Erhaltungszucht zu dissoziieren, und sich auf eine Aggregatzählung zu verlassen, ist ungenau, da die Aggregatgrößen variieren und daher die Gesamtzellzahl variabel und bestenfalls eine Schätzung ist. Mit dem NucleoCounter® NC-202™ können Sie eine direkte Aggregatdissoziation zum Zeitpunkt der Zählung mit dem Aggregated Cell Count Assay durchführen und erhalten in zwei Minuten eine genaue Zellzahl und den Prozentsatz der Lebensfähigkeit.

Das NC-202™ ist nicht auf eine vollständige Dissoziation zu einzelnen Zellen angewiesen, da es die Kerne von lebenden und toten Zellen anhand von Fluoreszenzfärbungen zählt. So kann das Gerät einzelne Zellen in kleinen Klumpen besser erkennen, da sich die Zellkerne der Zellen in einem Klumpen weniger überlappen als bei automatischen Zellzählern, die auf Hellfeld-Mikroskopbildgebungen basieren.

Durch die Verwendung der Via2-Cassette™ eliminieren Sie eine Verzerrung der Zählung von Benutzer zu Benutzer und vermeiden die Handhabung von Zellfärbereagenzien, da diese in die Kassette eingebettet sind. Die individuell volumenkalibrierte Via2-Cassette™ unterstützt die Robustheit des NC-202™ und gewährleistet eine geringe Gerätevariation für einen höheren Differenzierungserfolg. Darüber hinaus ist das Gerät 21 CFR Part 11-fähig für die Integration in Programme, die GMP-Konformität erfordern.

Unsere Wissenschaftler im Außendiest (FAS) klären Fragen zum Geräteeinsatz für alle unsere Kunden. Die FAS besuchen auch Labore und führen Online-Gerätedemonstrationen durch und stehen für Diskussionen über Ihre iPSC-Zählmethoden zur Verfügung. Bei der Installation schult die FAS das Personal im Umgang mit dem Gerät und führen Leistungstests durch, um eine erfolgreiche Installation zu gewährleisten. Mit einem Wartungsprogramm können Sie die Produktgarantie verlängern und wir führen regelmäßige Servicebesuche durch, um die Geräteleistung zu überprüfen und Mitarbeiter zu schulen.

Verweise

  1. K Takahashi and S Yamanaka: Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 2006; 126, 663–676.
  2. K Takahashi, K Tanabe, M Ohnuki et al.: Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 2007; 131, 861–872.
  3. T Sato and H Clevers: Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 2013;340(6137):1190-4.
  4. SF Boj, AM Vonk, M Statia et al.: Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. 2017;(120):55159
  5. MA Lancaster, M Renner, C-A Martin et al.: Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501(7467):373-9.
  6. MNT Le, M Takahi, K Maruyama et al.: Cardiac differentiation at an initial low density of human-induced pluripotent stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2018;54(7):513-522.
  7. H Ninomiya, K Mizuno, R Terada et al.: Improved efficiency of definitive endoderm induction from human induced pluripotent stem cells in feeder and serum-free culture system. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2015. 51(1):1-8.
  8. S Srimasorn, M Kirsch, S Hallmeyer-Ellgner et al.: Increased Neuronal Differentiation Efficiency in High Cell Density-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Int. 2019. Volume 2019 |Article ID 2018784.
  9. SM Chambers, CA Fasano, EP Papapetrou et al.: Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 2009. 27(3):275-80.

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