Onkologie

Assays zur Zählung und Analyse von Krebszellen

Unabhängig davon, ob Forscher daran arbeiten, die genetischen oder umweltbedingten Faktoren für die Krebsentstehung aufzudecken, ist die Untersuchung einzelner Krebszellen der Schlüssel zur Identifizierung möglicher Ursachen für einzelne Krebsarten. Da Krebs eine der häufigsten Todesursachen weltweit ist, ist die Entwicklung neuer Therapien zur Krebsbekämpfung von enormer Bedeutung. Aus diesem Grund benötigt die Krebsforschung eine schnelle, zuverlässige und detaillierte Zellanalyse.

Der NucleoCounter® NC-3000™ bietet eine schnelle Zellzyklusanalyse und ein umfassendes Angebot an Plug-and-Play-Apoptose-Assays, mit denen der Anwender detaillierte Analysen der Vitalität von Krebszellen durchführen kann. NucleoCounter® Geräte können auch die Lebensfähigkeit und Zellzahl von Krebszellen mit extremer Präzision und Geschwindigkeit bestimmen, selbst wenn diese in Sphäroiden oder auf Mikrocarriern gezüchtet werden.

Analysieren von Zellzyklen

Im Gegensatz zu normalen Zellen unterziehen sich Krebszellen aufgrund von Mutationen in Genen, die normalerweise den Zellzyklus regulieren würden, einer unkontrollierten Zellteilung, was oft zu soliden Tumoren führt. Daher sind Zellzyklusstudien essentiell für das Verständnis von Krebserkrankungen und gehören zu den effektivsten Instrumenten in diesem Forschungsbereich.

Der NucleoCounter® NC-3000™ bietet eine schnelle und einfache Zellzyklusanalyse in weniger als fünf Minuten, den sogenannten Zwei-Schritt-Zellzyklus-Assay. Nach Zugabe eines Lysepuffers, der mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff versetzt ist, werden alle Zellkerne angefärbt. Das NC-3000™ kann dann die Probe messen und analysieren.

Die begleitende NucleoView™-Software des Geräts zeigt sofort ein Zellzyklusprofil an, mit dem Sie Ereignisse in der Sub-G1-Phase, G0/G1-Phase, S-Phase und G2/M-Phase identifizieren können. Mit dem Softwarepaket FlexiCyte™ eignet sich der NucleoCounter® NC-3000™ sogar für die Untersuchung der Zellproliferation. Durch den Nachweis des BrdU- und EdU-Einbaus mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern ermöglicht dieser Assay fortgeschrittene Studien der Zellproliferation.

Die verschiedenen Zellzyklusphasen lassen sich anhand des DNA-Gehalts mit einer fluoreszierenden DNA-Färbung unterscheiden (Abbildung, links).

Der zweistufige Zellzyklus-Assay von unbehandelten und mit Camptothecin (CPT) behandelten Jurkat-Zellen, zeigt die Intensität der DNA-Färbung DAPI und kann zur Definition von Zellzyklusereignissen in der Sub-G1-Phase, G0/G1-Phase, S-Phase und G2/M-Phase verwendet werden. Nach CPT-Behandlung wird der Zellzyklus in der G2/M-Phase arretiert (Abbildung, rechts). CPT ist ein Topoisomerase-Inhibitor, und einige seiner Derivate werden als Krebsmedikamente eingesetzt.

Plug-and-Play-Assays im NucleoCounter® NC-3000™

Zellzählung
Zellzahl- und Lebensfähigkeits-Assays: Hochpräzise Zellzählung von Säugetier-, Insekten- und Hefezellen aus einer Vielzahl von Proben- und Kulturtypen.

Apoptosis

  • Mitochondrialer Potentialtest: Frühe Apoptoseanalyse; erfasst Veränderungen des mitochondrialen Potentials
  • Annexin V-Assay: Analyse der frühen bis mittleren Apoptose; erkennt den Zusammenbruch der Phospholipid-Asymmetrie
  • Caspase-Assay: Analyse der frühen bis mittleren Apoptose; detektiert Veränderungen der Caspase 3/7, 8 und 9 Aktivität
  • Vitalitäts-Assay (VB-48): Analyse der späten Apoptose; erkennt Veränderungen der reduzierten Thiole
  • DNA-Fragmentierungs-Assay: Späte Apoptoseanalyse; erkennt fragmentierte DNA (Sub-G1)

Sonstige Assays

  • Zellzyklus-Assay: Einzigartiger 5-Minuten-Zellzyklus-Assay von lebenden oder fixierten Zellen unter Verwendung von entweder DAPI oder PI
  • GFP-Transfektionseffizienz-Assay: Zum Nachweis von GFP-transfizierten und nicht lebensfähigen Zellen (basierend auf Hoechst und PI)
  • FlexiCyte™-Assay: Benutzerdefiniertes Assay-Setup mit optionalen LEDs, Emissionsfiltern und Einstellungen

Zählen von Krebszellen, die in Sphäroiden Wachsen

Es besteht ein wachsender Bedarf an der Entwicklung repräsentativerer Modelle zur Durchführung von In-vitro-Tests der Zytotoxizität und des Wirkstoffscreenings in der Krebszellbiologie. Denn herkömmliche 2D-Zellkulturen können die Komplexität und Heterogenität von Tumoren in vivo nicht nachbilden.

Es wurden verschiedene 3D-Modelle entwickelt, darunter hängende Tropfen, Pelletkulturen, Sphäroid- und Organoidkulturen. Diese Expansions- und Screeningmodelle stellen eine Herausforderung bei der Bestimmung der Zellzahl von Krebszellen dar, die in 3D-Strukturen oder als Organoide mit mehreren Zelltypen wachsen, um ganze Krebsgewebe zu imitieren.

Die Geräte der NucleoCounter®-Familie sind mit Zellzähl- und Lebensfähigkeitstests ausgestattet, die speziell für 3D-Strukturen entwickelt wurden. Durch die Verwendung eines Lysepuffers zum Aufbrechen der 3D-Strukturen gewährleisten die Assays eine homogene Probe einzelner Zellkerne, die dann zur Detektion und Analyse mit DAPI angefärbt werden können.

Viabilität und Zellzahl von auf Mikrocarriern gewachsenen Krebszellen

Die Kultivierung von Krebszellen in 3D-Sphäroiden kann aufgrund von Mikroumweltgradienten, z. B. Sauerstoff und Nährstoffe, problematisch sein und die Wachstumsraten der Zellen begrenzen. Neben dieser Expansionsmethode ohne Anhaftung von Krebszellen in vitro können Krebszellen auch auf der Oberfläche von Mikrocarriern und im Inneren von makroporösen Mikrocarriern kultiviert werden. Diese Methoden können uns dabei helfen, die Rolle der Zellform und des Zellkontakts bei der Reaktion auf Krebsbehandlungen zu untersuchen.

Die Bestimmung der Konzentration und Lebensfähigkeit von Zellen, die in und auf Mikrocarriern gezüchtet wurden, ist äußerst anspruchsvoll und erfordert den zeitaufwändigen Prozess der Ablösung von Zellen mit Enzymen. Die NucleoCounter®-Instrumente bieten ein einzigartiges Programm zur Zählung und Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen, die direkt auf Mikrocarriern gewachsen sind. Sie können dies erreichen, indem Sie einen kurzen Lyse-Schritt unmittelbar vor dem Zählen hinzufügen, ohne dass ein vorgeschalteter Ablöseschritt erforderlich ist.

Die Zellen werden lysiert und die Kerne in Suspension gebracht (Bild A). Die Gesamtzahl der Zellen wird mit DAPI angefärbt und mit einem NucleoCounter® detektiert (Bild B). Mit der Softwareanalyse kann der Anwender überprüfen, inwieweit alle Zellen ordnungsgemäß erfasst wurden (Bild C). Anschließend werden die nicht lebensfähigen Zellen ohne Vorbehandlung mit einem Lysepuffer mit DAPI angefärbt, da alle abgestorbenen Zellen ohne Zelladhäsionen frei in Suspension sind und nicht mehr an den Mikrocarriern haften.

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NC-202™ Product Video