Stammzellforschung

Konsistente Zellzahl für Differenzierungserfolg

Stammzellen haben in den letzten zwei Jahrzehnten in akademischen und industriellen Bereichen große Aufmerksamkeit erlangt. Das liegt daran, dass diese Zellen das Potenzial besitzen, viele Krankheiten zu lindern oder sogar zu heilen. Vor der Verwendung in Arzneimitteln für neuartige Therapien (ATMPs) wird jedoch viel Forschungs- und Entwicklungsarbeit in therapiespezifische Technologien investiert. Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) werden von embryonalen Stammzellen (ESCs) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitet und traditionell auf Feeder-Zellen in einer 2D-Umgebung (einer Gewebekulturschale/Flasche) kultiviert. Um eine kontrollierte Stammzellnische zu schaffen, haben sich die Kultureinstellungen hin zu eingeschränkteren Bedingungen entwickelt, bei denen alle Komponenten serumfrei oder sogar xenofrei sind und verschiedene Kunststoff- oder Mikroträgerbeschichtungen verwendet werden, anstatt Feeder-Zellen in der Schale zu befestigen. Eine eingeschränkte Umgebung ermöglicht eine bessere Zell-zu-Zell-Signalübertragung und Kontrolle von Faktoren, die für die Art der gerichteten Differenzierung, an der Sie interessiert sind, verantwortlich sind und verwendet werden sollten.

Jüngste Entwicklungen haben dazu geführt, dass sich die Kultivierung von Stammzellen von traditionellen 2D-Methoden zu physiologisch relevanteren 3D-Methoden wie Sphäroid- und Organoidkulturen verlagert hat, die eine angemessene Zell-zu-Zell-Signalübertragung und Interaktionen während des Zellwachstums und der Differenzierung ermöglichen. Diese 3D-Strukturen sind für die Arzneimittelforschung und regenerative Medizin sehr vielversprechend, da sie es den Forschern ermöglichen, besser zu simulieren, wie ihre Behandlungen auf Gewebe in einer physiologisch/biologisch relevanten Umgebung wirken, anstatt ihre Wirkung in isolierten Zellschichten zu erforschen. Aufgrund ihrer physioplogischen Relevanz können organoide Kulturen auch bestimmte Tierversuche überflüssig machen, ohne dass die wissenschaftliche Aussagekraft der Ergebnisse beeinträchtigt wird.

Was ist die Herausforderung?

Neben den Kulturmedien, den Oberflächenbeschichtungen und dem Pluripotenzniveau der Zellen, mit denen Sie arbeiten, ist die Zelldichte der vierte wichtige Faktor für den experimentellen Erfolg. Die interzelluläre Signalübertragung ist schwer zu manipulieren, aber das Aussäen von Zellen in der richtigen Konzentration kann erheblich dazu beitragen, die gewünschte gerichtete Differenzierung zu erreichen. In Instanzen von Differenzierungsprotokollen, die für Mesoderm- und Endoderm-Zelltypen (z. B. Pankreasvorläufer) entwickelt wurden, hat sich gezeigt, dass sich niedrige Zelldichten positiv auf den Anteil der gewünschten Zellen auswirken1,2. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass bei niedrigen Zelldichten geringere Zytokinkonzentrationen erforderlich sind, um den gleichen Effekt zu erzielen, was wiederum erhebliche Kosten bei der Zellkultur einspart.

Umgekehrt erfordern neurale Differenzierungsprogramme oft hohe Zelldichten, da die Zell-zu-Zell-Signalübertragung unverzichtbar ist und die Zelldichte zu Versuchsbeginn das Verhältnis von neuronalen Zellen und zerebralen Organoiden bestimmt3,4.

Erhaltungskulturen von hPSCs werden in der Regel durchgeführt, indem dichte Kulturen als mittelgroße Aggregate (Klumpen) von Zellen passagiert werden, anstatt sie vor der Replikation in einzelne Zellen zu dissoziieren. Dadurch wird sichergestellt, dass die hPSC-Nische während der Passage und über mehrere Passagen hinweg nicht zu sehr gestört wird, was zu genetischem Drift und einer Abnahme der Pluripotenz führen könnte.

Optimierung der Zellzählung und Viabilitätsanalyse bei iPS-Zellarbeiten

Um Konsistenz und Reproduzierbarkeit bei der Kultivierung von Stammzellen zu gewährleisten, benötigt man präzise Methoden zur Abschätzung der Zellkonzentration und Lebensfähigkeit. Der automatisierte Zellzähler NucleoCounter® NC-202™ bietet eine breite Palette an spezialisierten Assays für hPSCs in Zellsuspension, in Aggregaten oder auf Mikroträgern gewachsen. Er ist einfach zu bedienen, eliminiert menschliche Einflüsse und Schwankungen aus dem Zählprozess und benötigt nur 30 Sekunden pro Zellzählung.

Wenn Sie Zellzählung und Lebensfähigkeitsanalyse zusammen mit maßgeschneiderten zellulären Färbungen Ihrer Wahl kombinieren möchten, wird der  NucleoCounter® NC-3000™  mit einem flexiblen Programm geliefert, welches bis zu fünf Kanäle zur Analyse von bis zu acht Proben pro Objektträger bietet. Die Software des Instruments (NucleoView™) erzeugt vollständige Fluoreszenzbilddaten und Histogramme mit modifizierbaren Gate-Einstellungen, um Ihnen die volle Kontrolle über Ihre Datenanalyse zu geben.

Weitere Informationen darüber, wie Sie Ihre Analyse von hPSCs für Stammzelltherapien verbessern können, finden Sie auf den folgenden Seiten:

Mesenchymal Stammzellen (MSCs)
Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs)
Hämatopoetische Stammzellen (HSCs)

Verweise

  1. AE Chen, M Borowiak, RI Sherwood et al.: Functional evaluation of ES cell-derived endodermal populations reveals differences between Nodal and Activin A-guided differentiation. Development. 2013; 140(3):675-86. 
  2. M Hansson, DR Olesen, JML Peterslund et al.: A late requirement for Wnt and FGF signaling during activin-induced formation of foregut endoderm from mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 2009; 330(2):286-304. 
  3. Srimasorn, M Kirsch, S Hallmeyer-Ellgner et al.: Increased Neuronal Differentiation Efficiency in High Cell Density-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Int. 2019; 2019:2018784. 
  4. MA Lancaster and JA KnoblichGeneration of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014; 9(10):2329-40. 

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