Nachweis von Apoptose mit VitaBright

Zellvitalitätsanalyse in 1 Minute

Der Zellgehalt an Thiolen wie Glutathion (GSH) nimmt als spezifische Reaktion auf die Apoptose ab. Um dies zu messen, haben wir zwei Thiol-reaktive Fluoreszenzsonden, VitaBright-43™ und VitaBright-48™, entwickelt, die zum Nachweis von Apoptose mit dem Vitality-Assay für den NucleoCounter® NC-3000™ verwendet werden können.

Verwenden Sie VitaBright-43™, um frühe bis mittlere apoptotische Ereignisse zu erkennen, und VitaBright-48™ für mittlere bis späte apoptotische Ereignisse. Mit dem NucleoCounter ® NC-3000™ dauert Ihre Vitalitätsanalyse nur eine Minute und ist sehr einfach durchzuführen. Sie können bis zu acht Proben gleichzeitig analysieren.

Erkennung früher und später apoptotischer Ereignisse

Freie Thiole spielen viele wichtige Rollen in der Zellbiologie. Das vorherrschende zelluläre Oxidationsmittel ist reduziertes Glutathion (GSH), das vor oxidativen Schäden schützt. Der Oxidationsstatus von GSH bestimmt weitgehend den Thiol-Disulfid-Status (GSSG) und nachfolgend das zelluläre Redoxpotential1. Es wurde festgestellt, dass die GSH-Konzentration bei der Induktion von Apoptose aufgrund von GSH-Extrusion abnimmt, auch bei der Induktion von Apoptose mit nicht-oxidativen apoptogenen Mitteln,2-5.

VitaBright-43™ und VitaBright-48™ sind zellpermeable Maleimid-Derivate, die mit Thiol-Gruppen auf Proteinen reagieren und dabei thioestergekoppelte fluoreszierende Produkte erzeugen6,7. Mit Hilfe der Mehrfarbenzytometrie wird deutlich, dass bei der Induktion der Apoptose eine weniger intensive VitaBright-43™-Färbung mit dem Zeitpunkt der Phosphatidylserin-Externalisierung und einer erhöhten Caspase 3/7-Aktivität korreliert2. Dies macht VitaBright-43™ zu einer idealen Sonde zur Erkennung früher bis mittlerer apoptotischer Ereignisse.

Die Zellen färben weniger intensiv für VitaBright-48™während der späteren Stadien der Apoptose und dies ist umgekehrt korreliert mit der Färbung für den Apoptosemarker Annexin V und nach dem Verlust des mitochondrialen Potenzials, gemessen mit einer JC-1-Färbung7. Somit ist VitaBright-48™ ein idealer Marker für Apoptose im mittleren bis späten Stadium.

Das Prinzip der VitaBright-Färbung und -Analyse

Wenn VitaBright in die Zellkultur gegeben wird, durchdringt es die Zellmembran und reagiert sofort mit intrazellulären Thiolen, wobei eine blau-fluoreszierende Verbindung entsteht. Die Intensität der Blau-Fluoreszenz korreliert direkt mit der zellulären Konzentration von GSH. Außerdem sinkt der GSH-Spiegel und nachfolgend der Spiegel der freien Thiole, wenn die Apoptose induziert wird. Daher kann die Messung des Gehalts an freien Thiolen zur Quantifizierung der Apoptose verwendet werden.

VitaBright bietet eine sehr schnelle, einfache und zuverlässige Möglichkeit, Apoptose mittels Durchfluss- oder Bildzytometrie zu bestimmen. Da keine Inkubations- oder Waschschritte erforderlich sind, helfen diese Farbstoffe, fragile apoptotische Zellen zu erhalten, die bei Waschschritten oft verloren gehen. Um zwischen nekrotischen und apoptotischen Zellen zu unterscheiden, sollte die VitaBright-Färbung mit einer undurchlässigen Färbung, wie z. B. Propidiumjodid (PI), kombiniert werden.

Vitalitätsanalyse von Jurkat- und WeHi-S-Zellen

Diese Abbildung (links), die den Multiplex-Assay darstellt, zeigt, dass die VitaBright-43™-Färbung gut mit der Phosphatidylserin-Externalisierung und der Caspase 3/7-Aktivität in Jurkat- und WeHi-S-Zellen korreliert. Mit fortschreitender Apoptose nehmen die Signale von Annexin V CF-647 und NucView 488 zu, während das VitaBright-43™-Signal in einer Untergruppe der Zellpopulation abnimmt.

Panel A zeigt Jurkat-Zellen, die mit 5 µM Camptothecin (CPT) für 0, 2 bzw. 4 Stunden behandelt wurden. Die Zellen wurden mit VitaBright-43™ (blau), Annexin V CF-647 (rot) und SYTOX grün (grün) gefärbt und mittels Bildzytometrie mit dem NucleoCounter® NC-3000™ analysiert. Die Punktediagramme zeigen VitaBright-43™ versus Annexin V CF-647-Intensitäten. Tote Zellen wurden anhand der SYTOX-Grün-Aufnahme aussortiert. Das Panel ganz rechts zeigt ein Bild der CPT-behandelten Probe.

Panel B zeigt WeHi-S-Zellen, die mit 10 ng/µl TNF-α für 0, 2 bzw. 4 Stunden behandelt wurden. Die Zellen wurden mit VitaBright-43™ (blau), NucView 488 (grün) und PI (rot) gefärbt und mittels Bildzytometrie mit dem NC-3000™ analysiert. Die Punktediagramme zeigen die Intensitäten von VitaBright-43™ gegenüber NucView 488. Tote Zellen wurden anhand der PI-Aufnahme aussortiert. Das ganz rechte Panel zeigt ein Bild der TNF-α-behandelten Probe.

Verweise

  1. SM Deneke and BL Fanburg: Regulation of cellular glutathione. Am J Physiol. 1989; 257(4 Pt 1):L163-73.
  2. L Ghibelli, S Coppola, G Rotilio et al.: Non-oxidative loss of glutathione in apoptosis via GSH extrusion. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 216(1):313-20.
  3. AF Slater, CS Nobel, E Maellaro et al.: Nitrone spin traps and a nitroxide antioxidant inhibit a common pathway of thymocyte apoptosis. Biochem J. 1995; 306 (Pt 3):771-8.
  4. DJ v/d Dobbelsteen, CS Nobel, J Schlegel et al.: Rapid and specific efflux of reduced glutathione during apoptosis induced by anti-Fas/APO-1 antibody. J Biol Chem. 1996; 271(26):15420-7.
  5. A Macho, T Hirsch, I Marzo et al.: Glutathione depletion is an early and calcium elevation is a late event of thymocyte apoptosis. Immunol. 1997; 158(10):4612-9.
  6. ME Skindersoe, M Rohde and S Kjaerulff: A novel and rapid apoptosis assay based on thiol redox status. Cytometry A. 2012; 81(5):430-6.
  7. M E Skindersoe and S Kjaerulff: Comparison of three thiol probes for determination of apoptosis-related changes in cellular redox status. Cytometry A. 2014; 85(2):179-87.