Zellzahl und Viabilität aggregierter Zellen

Fluoreszenzfarbstoffe Färben Zellkerne in Aggregaten, Microcarriern und Sphäroiden

NucleoCounter®-Geräte bieten zuverlässige Lösungen für die Zählung von Zellen in Klumpen und Aggregaten. Sie verwenden Fluoreszenzfarbstoffe, um Zellkerne zu färben, und setzen einen leistungsfähigen Algorithmus ein, um einzelne Kerne innerhalb jedes kleineren Aggregats zu segmentieren.

Bei stärker verklumpten Proben ermöglicht eine numerische Schätzung des Zellaggregationsgrads dem Bediener eine fundierte Entscheidung, ob er zum speziellen Aggregierte-Zell-Assay wechseln soll, der die Zellen mit einem Lyseschritt auflöst. Dieser spezielle Assay wird auch zum Zählen von Zellen verwendet, die auf Microcarriern oder in Sphäroiden gewachsen sind.

Licht- versus Fluoreszenzmikroskopie zur Zählung von Zellen in Aggregaten

Die Lichtmikroskopie hebt die Kontur von Objekten anhand ihres Schattenmusters hervor. Die Zählung von Zellen mit konventionellen lichtmikroskopischen Verfahren kann dazu führen, dass Kontaminationen und zelluläre Trümmer eingeschlossen werden, die visuell nicht von Zellen zu unterscheiden sind. Insbesondere wenn sich die Außenkontur benachbarter Zellen überlappt, wie im Fall von Zellklumpen, kann es nahezu unmöglich sein, einzelne Zellen genau zu identifizieren.

NucleoCounter® Geräte nutzen Acridinorange (AO) und DAPI, beides Fluoreszenzfarbstoffe mit DNA-Affinität, um Zellkerne mit großer Spezifität zu markieren und hochkontrastreiche Signale zu erzeugen. Zellkerne sind kleiner als ganze Zellen und  entsprechend besser zu segmentieren, wenn Zellen kleine Aggregate bilden. Außerdem werden zelluläre Trümmer und andere Artefakte, die sonst in der Lichtmikroskopie sichtbar wären, in der Fluoreszenzmikroskopie nicht mehr erkannt.

Artefakte, die bei lichtmikroskopischen Techniken, wie z. B. Hellfeld, sichtbar sind, sind bei der Verwendung von Fluoreszenzfiltern nicht sichtbar. Die AO-Färbung führt zu einem verstärkten Signal der Zellkerne, wodurch einzelne Zellen in Aggregaten leichter identifiziert werden können.

Prinzip der Automatisierten Bildanalyse mit NucleoCounter® Software

NC-View™ und NucleoView™ sind die Softwareplattformen für die Geräte NucleoCounter® NC-202™ und NucleoCounter® NC-200™. Die Software verwendet einen leistungsstarken Algorithmus, um einzelne Zellen innerhalb kleinerer Aggregate genau zu identifizieren und zu analysieren.
Zellen, die nahe beieinander liegen, zeigen immer noch identifizierbare diskrete Peaks, auch wenn sich ihre entsprechenden Steigungen überlappen können.

Die mit dem NucleoCounter®-Gerät aufgenommenen Bilder werden sofort von dem leistungsstarken Algorithmus der Software verarbeitet. Intensitätspeaks und Steigungen werden zur Segmentierung einzelner Zellen, auch innerhalb von Aggregaten, verwendet.

Die Daten werden als Fluoreszenzbilder angezeigt, damit der Benutzer lebende und tote Zellen identifizieren und evaluieren kann. Mit dem NucleoCounter® NC-3000™ werden die Daten auch als Histogramme mit einstellbaren Gate-Einstellungen zur tieferen Analyse angezeigt. Damit ist es dem Benutzer möglich, auch einzelne Zellen und Zellpopulationen zurück zu verfolgen.

NucleoCounter®-Geräte ermöglichen eine numerische Abschätzung der Zellaggregation

Das NucleoCounter®-System ist überlegen bei der Segmentierung von Zellen innerhalb kleiner Aggregate von weniger als fünf Zellen. In Proben mit größeren Aggregaten neigen Zellen dazu, sich gegenseitig überlappen, was die Analyse dieser Proben sehr schwierig macht. Tatsächlich sind manuelle und automatisierte Zellzählungen, die sich auf lichtmikroskopische Techniken wie Hellfeldmikroskopie und Phasenkontrast stützen, nur unzureichend in der Lage, den Grad der Aggregation in einer Probe abzuschätzen.

Der NucleoCounter®-Bediener erhält eine Schätzung des Prozentsatzes der Aggregation in der Probe; daraus kann er eine fundierte Entscheidung treffen, ob er den speziellen Aggregations-Zellzahl-Assay wählt, mit dem er die Zellzahl genau beurteilen kann.

Zählen von hochgradig aggregierten Zellen oder Klumpen

Gewebeproben und bestimmte Zelltypen, die in Sphäroiden oder auf Microcarrieren gezüchtet werden, wie z. B. MCF-7, HepG2 und iPS-Zellen, neigen dazu, große Klumpen zu bilden, die gegenüber enzymatischen oder mechanischen Trennungsmethoden widerstandsfähig sind. Einzelne Zellen in solch großen Aggregaten werden wahrscheinlich überlagert, was die Genauigkeit und Präzision einer Zellzählung verringert.

Die Software NC-View™ und NucleoView™ geben den Prozentsatz der Zellen in Aggregaten von mehr als fünf Zellen an. Dadurch werden Proben markiert, bei denen es zu einer Zellaggregation kommt, was die Bestimmung der Zellzahl beeinflussen könnte. Für solche Proben wird der spezielle Aggregierte-Zellzahl-Assay empfohlen. Bei diesem Assay stammt die Gesamtzellzahl aus einem separaten lysierten Aliquot der Probe. Durch den Lyseprozess wird die Zellmembran zerstört, wodurch Klumpen aufgelöst und die Kerne zur Färbung in Lösung gegeben werden. Da tote Zellen in der Regel weniger häufig vorkommen und dazu neigen, sich von Aggregaten zu lösen, kann die Anzahl der toten Zellen immer noch auf dem nicht lysierten Aliquot basieren.