Annexin V-Assay

Nachweis von Apoptose mit Annexin V und NucleoCounter ® NC-3000 ™

  • Feststellen, ob sich Zellen im frühen oder späten Stadium der Apoptose/Nekrose befinden
  • Schnelle, automatisierte Einzelzellanalyse
  • Standardisierte Ergebnisse – auch zwischen verschiedenen Benutzern
  • Benutzerfreundliches Programm mit vordefinierten Einstellungen
  • Keine Kalibrierung erforderlich
  • Übersichtliche Datendarstellung mit der Funktion Plot Manager
  • Automatisierte PDF-Berichte
  • Exportieren Sie Daten in FCS- / ACS-Formaten

Übersicht über den Annexin-V-Assay

Die Externalisierung oder Translokation von Phosphatidylserin (PS) vom inneren zum äußeren Membranblatt geschieht in der frühen Apoptose und geht anderen apoptotischen Ereignissen wie dem Verlust der Membranintegrität und der DNA-Fragmentierung voraus.

Annexine sind eine Gruppe von zellulären Proteinen, die calciumabhängig an Phospholipide binden. Ein Mitglied dieser Gruppe, Annexin V, hat sich als nützliches Werkzeug zum Nachweis apoptotischer Zellen erwiesen, da es eine hohe Affinität zu PS hat und somit mit PS zur äußeren Zellmembran transloziert.

Mit fluoreszenzmarkiertem Annexin V kann die Externalisierung von PS leicht nachgewiesen werden. Annexin V kann auch an PS auf späten apoptotischen und nekrotischen Zellen binden, aber da die Membranintegrität auf diesen Zellen verloren gegangen ist, können sie mit Propidiumiodid (PI) von frühen apoptotischen Zellen unterschieden werden. Der PI-Farbstoff ist nicht membranpermeabel und wird zum Anfärben von Zellen und DNA verwendet.

Assay-Prinzip

Mittels Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erkennt das erweiterte Bildzytometer NucleoCounter® NC-3000™ automatisch apoptotische Zellen anhand der PS-Externalisierung. Die Zellen sind mit Hoechst 33342, PI und FITC-markiertem Annexin V gefärbt.
Hoechst 33342 färbt die gesamte Zellpopulation, während Annexin V apoptotische und nekrotische Zellen färbt. Frühe apoptotische Zellen schließen PI aus, während apoptotische und nekrotische Zellen im Spätstadium sowohl für Annexin V als auch für PI positiv färben.

Ergebnisse im Plot Manager dargestellt

Das Diagramm zeigt die Wirkung der Zugabe von Camptothecin (CPT) auf Jurkat-Zellen. CPT ist ein häufig verwendetes Topoisomerase-Gift, das Apoptose induziert, was zur Externalisierung von PS führt und die Bindung von Annexin V ermöglicht. Jurkat-Zellen sind eine immortalisierte Linie menschlicher T-Lymphozyten-Zellen, die häufig zur Untersuchung der Wirksamkeit potenzieller Anti-Krebs-Substanzen verwendet werden.

Jurkat-Zellen wurden in Abwesenheit (obere Reihe) oder Anwesenheit (untere Reihe) von Camptothecin (CPT) gezüchtet. Die Zellen wurden mit Hoechst 33342, Annexin V-Fluorescein Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem Antikörper und Propidiumjodid (PI) angefärbt und mit dem Annexin V Assay mit dem NucleoCounter® NC-3000™ analysiert.

Punktediagramme und Histogramme wurden mit der Software NucleoView™ NC-3000™ erstellt. Quadranten (B, F) und Marker (C, D, G, H) in den dargestellten Plots wurden zur Abgrenzung der verschiedenen Zellpopulationen verwendet. In diesem Beispiel verursacht CPT einen signifikanten Anstieg von früh apoptotischen Zellen (markiert als Annexin V-positive und PI-negative Zellen im unteren rechten Quadranten, F).