Caspase 3/7, 8 oder 9 Assay

Nachweis der Apoptose mit dem FLICA-Assay

  • Bestimmung der aktiven Caspase 3/7, Caspase 8 oder Caspase 9
  • Benutzerfreundliches Programm mit vordefinierten Einstellungen
  • Quantifizierung der spezifischen Caspase-Aktivität auf zellulärer Ebene
  • Feststellen, ob sich Zellen im frühen oder späten Stadium der Apoptose/Nekrose befinden
  • Schnelle, automatisierte Einzelzellanalyse
  • Übersichtliche Datendarstellung mit der Funktion Plot Manager
  • Automatisierte PDF-Berichte
  • Exportieren Sie Daten in FCS- / ACS-Formaten

Überblick über den Caspase-Assay

Caspasen (Cystein-Aspartat-Proteasen, Cystein-Aspartasen oder Cystein-abhängige Aspartat-gerichtete Proteasen) sind eine Familie von Protease-Enzymen, die für die Ausführung des programmierten Zelltodes essentiell sind. Sie sind die wichtigsten Exekutoren des apoptotischen Prozesses; bei Aktivierung vermitteln Caspasen die Apoptose durch Proteolyse spezifischer Substrate.

Unser Caspase 3/7, 8 oder 9 Assay misst die Aktivität unter Verwendung einer Caspase-spezifischen Inhibitorsequenz, die mit einer Fluoreszenzsonde verbunden ist. Die gemessene Fluoreszenz gibt somit ein direktes Maß für die Menge der aktiven Caspase in der gesamten lebenden Zelle. Tote Zellen werden mit Propidiumjodid (PI) identifiziert. Dieser Assay ist als Fluorochrom-markierter Inhibitor von Caspasen Assay (FLICA) bekannt.

Assay-Prinzip

Bei unserem Caspase-Apoptose-Assay (FLICA) wird die Caspase-Aktivität mit einer Caspase-spezifischen Inhibitor-Sequenz gemessen, die mit einer Fluoreszenzsonde verbunden ist.

Der nicht-zytotoxische Caspase-spezifische Inhibitor ist zellpermeant und passiert die intakte Plasmamembran, wo er kovalent an den reaktiven Cystein-Rest der großen Untereinheit des aktiven Caspase-Heterodimers bindet. Ungebundener Caspase-Inhibitor diffundiert aus der Zelle heraus und wird weggewaschen, so dass keine Störungen durch Pro-Caspasen oder inaktive Formen des Enzyms entstehen. Die gemessene Fluoreszenzerlaubt daher eine direkte Quantifizierung der Menge der aktiven Caspase in der gesamten lebenden Zelle. Tote Zellen werden mit PI identifiziert.

Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse automatisiert das NucleoCounter® NC-3000™-System die Erkennung von apoptotischen Zellen anhand der Caspase-Aktivität. Die Zellen werden mit Hoechst 33342, PI und Carboxyfluorescein-markiertem FLICA-Reagenz gefärbt.

Die gesamte Zellpopulation ist mit Hoechst 33342 (blau) gefärbt, während frühe apoptotische Zellen und späte apoptotische/nekrotische Zellen mit Carboxyfluorescein-markiertem FLICA-Reagenz (grün) bzw. PI (rot) gefärbt sind.

Ergebnisse im Plot Manager dargestellt

Das Diagramm demonstriert die Wirkung der Zugabe von Camptothecin (CPT) zu Jurkat-Zellen in der Kultur. CPT ist ein häufig verwendetes Topoisomerase-Gift, das die Apoptose induziert und damit die Caspasen aktiviert. Jurkat-Zellen sind eine immortalisierte Linie menschlicher T-Lymphozyten-Zellen, die häufig zur Untersuchung der Wirksamkeit potenzieller Anti-Krebs-Substanzen verwendet werden.

Jurkat-Zellen wurden in Abwesenheit (obere Reihe) oder Anwesenheit (untere Reihe) von Camptothecin (CPT) gezüchtet. Die Zellen wurden mit Hoechst 33342, FLICA-Reagenz (FAM) und PI angefärbt und mit dem Caspase 3/7, 8, oder 9 Assay mit dem NucleoCounter® NC-3000™ analysiert. Punktediagramme und Histogramme wurden in der NucleoView™ NC-3000™ Software erstellt. Polygone und Marker in den dargestellten Plots wurden zur Abgrenzung der verschiedenen Zellpopulationen verwendet. In diesem Beispiel verursacht CPT einen signifikanten Anstieg der frühen apoptotischen Zellen (markiert als Caspase FAM-positive und PI-negative Zellen im unteren rechten Quadranten des zweiten Plots).