DNA-Fragmentierungs-Assay

Zur Auswertung der späten Apoptose mit dem NucleoCounter® NC-3000™

  • Einfaches Messen der DNA-Fragmentierung
  • Erfassung und Analyse in einem einfachen Schritt
  • Benutzerfreundliches Programm mit vordefinierten Einstellungen
  • Keine RNase-Behandlung erforderlich
  • Keine Kalibrierung erforderlich
  • Übersichtliche Datendarstellung mit der Funktion Plot Manager
  • Automatisierte PDF-Berichte
  • Exportieren Sie Daten in FCS- / ACS-Formaten

Übersicht über den DNA-Fragmentierungs-Assay

Während der Apoptose wirken Proteine auf die chromosomale DNA ein und fragmentieren die DNA zu Leitern. Dieses spät-apoptotische Ereignis wird durch die Messung des DNA-Gehalts nachgewiesen, ähnlich wie in unserem Zellzyklus-Assay. In apoptotischen Zellen sehen Sie eine Auflösung der Peaks in den G1- und G2-Phasen und den Anstieg eines „Sub-G1-Peaks“, der mit dem Fortschreiten des chromosomalen DNA-Laddering wächst.

Der Mechanismus des DNA-Abbaus ist die Aktivierung von Calcium- und Magnesium-abhängigen Nukleasen im Verlauf der Apoptose. Als Folge davon kommt es innerhalb der DNA zu Einkerbungen und Doppelstrangbrüchen, die eine Fragmentierung verursachen1. Dies ist ein spätes apoptotisches Ereignis, das durch die Quantifizierung des DNA-Gehalts der Zellen nachgewiesen werden kann. Apoptotische Zellen im Spätstadium haben einen geringeren DNA-Gehalt und können so als in der Sub-G1-Phase befindlich identifiziert werden.

Assay-Prinzip

Mittels Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erkennt der NucleoCounter® NC-3000™ automatisch Zellen mit fragmentierter DNA (Sub-G1-Zellen).

Nach dem Anfärben fixierter Zellen mit DAPI wird die Probe mit dem NucleoCounter® NC-3000™-System analysiert, wobei die zelluläre Fluoreszenz quantifiziert und apoptotische Zellen mit fragmentierter DNA als Sub-G1-Peak in einem auf dem Computerbildschirm angezeigten DNA-Gehalt-Histogramm identifiziert werden.

Mit Hilfe von Markern im Histogramm können apoptotische Zellen abgegrenzt werden.

Ergebnisse im Plot Manager dargestellt

Jurkat-Zellen wurden in Abwesenheit (obere Reihe) oder in Anwesenheit (untere Reihe) von Camptothecin gezüchtet und die Zellen wurden mit dem DNA-Fragmentierungs-Assay und einem NucleoCounter® NC-3000™ analysiert.

Punktediagramme und Histogramme wurden mit der NucleoView™ NC-3000™-Software erstellt. Markierungen in den dargestellten Histogrammen dienten der Abgrenzung von Zellen mit fragmentierter DNA (Sub-G1-Zellen). Die farbigen Histogramme sind eine Zusammenführung von unbehandelten (blaue Linie) und mit Camptothecin behandelten (rote Linie) Proben.

Referenz

  1. BD Larsen and CS Sørensen: The caspase‐activated DNase: apoptosis and beyond. FEBS J. 2017; 284(8): 1160-1170.