Mitochondriales Potential-Assay

Beurteilung der Apoptose mit dem lipophilen Farbstoff JC-1

  • Einfache Unterscheidung von polarisierten (gesunden) Zellen, depolarisierten (apoptotischen) Zellen und nekrotischen/späten apoptotischen Zellen
  • Schnelle, automatisierte Einzelzellanalyse
  • Erfassung und Analyse in einem einfachen Schritt
  • Standardisierte Ergebnisse – auch mit verschiedenen Benutzern
  • Keine Kalibrierung erforderlich
  • Übersichtliche Datendarstellung mit der Funktion Plot Manager
  • Automatisierte PDF-Berichte
  • Exportieren Sie Daten in FCS- / ACS-Formaten

Überblick über den Mitochondrialen Potential-Assay

Der lipophile kationische Farbstoff JC-1 kann zur Beurteilung des mitochondrialen Potentials verwendet werden. In gesunden Zellen erleichtert die negative Ladung, die durch das intakte mitochondriale Membranpotenzial entsteht, die Anreicherung von JC-1 in der mitochondrialen Matrix.

Es ist bekannt, dass der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials der Apoptose und der chemischen Hypoxie-induzierten Nekrose vorausgeht. JC-1 zeigt eine potentialabhängige Akkumulation in den Mitochondrien und hat dual-fluoreszierende Eigenschaften: Rote Fluoreszenz zeigt an, dass der Farbstoff Aggregate gebildet hat, während grüne Fluoreszenz anzeigt, dass der Farbstoff als Monomer vorliegt. Dies ist eine einfache, fluoreszenzbasierte Methode zur Unterscheidung von gesunden Zellen (Färbung rot) von apoptotischen Zellen (Färbung grün) in einer Probe.

Assay-Prinzip

Mittels Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erkennt das erweiterte Bildzytometer NucleoCounter® NC-3000™ automatisch Zellen mit kollabiertem mitochondrialem Membranpotenzial. Die Zellen sind mit JC-1 und DAPI gefärbt (Lösung 7 bzw. Lösung 8).

Zelluläre JC-1 Monomere und Aggregate werden als grüne bzw. rote Fluoreszenzintensität erkannt. Die mitochondriale Depolarisation zeigt sich in einer Abnahme des Rot-/Grün-Fluoreszenzverhältnisses. Nekrotische und spät apoptotische Zellen werden als blau fluoreszierende (d.h. DAPI-positive) Zellen erkannt.

Ergebnisse im Plot Manager dargestellt

Das Diagramm zeigt die Wirkung der Zugabe von Camptothecin (CPT) auf Jurkat-Zellen. CPT ist ein häufig verwendetes Topoisomerase-Gift, das  Apoptose induziert und damit das mitochondriale Potenzial der Zellen stört. Jurkat-Zellen sind eine immortalisierte Linie menschlicher T-Lymphozyten-Zellen, die häufig zur Untersuchung der Wirksamkeit potenzieller Anti-Krebs-Substanzen verwendet werden.

Jurkat-Zellen wurden in Abwesenheit (obere Reihe) oder in der Anwesenheit (untere Reihe) von Camptothecin (CPT) gezüchtet. Die Zellen wurden mit JC-1 und DAPI angefärbt und mit dem mitochondrialen Potential-Assay analysiert. Punktediagramme und Histogramme wurden mit der NucleoView™ NC-3000™ Software erstellt.
Polygone und Marker in den dargestellten Plots dienen zur Abgrenzung der verschiedenen Zellpopulationen. In diesem Beispiel sind 9% der unbehandelten Zellen depolarisiert/apoptotisch, während 61% der CPT-behandelten Zellen depolarisiert/apoptotisch sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CPT einen starken Einfluss auf das mitochondriale Potenzial hat.