Cytométrie en image vs en flux - Une comparaison des événements apoptotiques

Recherche en biologie cellulaire à l'Université de Copenhague

La mort cellulaire par apoptose est un processus complexe et rigoureusement régulé dans lequel une cellule provoque sa propre destruction en réponse à des stimuli internes ou externes spécifiques. Une dérégulation de l’apoptose peut entraîner divers troubles physiques tels que le cancer et l’auto-immunité. Les informations sur l’apoptose sont généralement obtenues soit par cytométrie en flux soit par microscopie en fluorescence.

La cytométrie en flux fournit des informations quantitatives sur des milliers de cellules mais ne permet pas de les visualiser. En revanche, la microscopie en fluorescence fournit des informations visuelles, mais ne permet pas de quantifier facilement de grandes populations cellulaires. La cytométrie en image comble le fossé entre ces deux technologies en permettant une analyse quantitative et une visualisation de milliers de cellules en même temps.

Comparaison entre l’évaluation par cytométrie en image et en flux

Les cellules répondent aux signaux apoptotiques en déclenchant des processus intracellulaires qui provoquent des changements physiologiques caractéristiques. Parmi ces changements, nous observons l’externalisation de la phosphatidylsérine au niveau de la membrane cellulaire, la dépolarisation du potentiel de membrane mitochondriale, l’activation des protéases, le compaction et la fragmentation de la chromatine, la perte d’intégrité membranaire et le rétrécissement de la cellule.

Nous avons examiné trois marqueurs différents couramment utilisés pour la détection des cellules apoptotiques :

Les cellules à croissance exponentielle (non-traitées) et les cellules traitées à la camptothécine (CPT) ont été marquées à l’Annexine V conjuguée au FITC (un peptide liant la phosphatidylsérine externalisée), l’Hoechst-33342 et à l’iodure de propidium (PI).

  1. A) La fraction de cellules positives pour l’Annexine V et pour le PI a été déterminée par cytométrie en flux (volet supérieur) et cytométrie d’image (volet inférieur). Chaque tarte représente la moyenne de six échantillons (trois échantillons indépendants analysés en double).
  2. B) Micrographie de cellules CHO traitées au CPT. La micrographie a été produite par superposition d’images capturées respectivement dans les canaux bleu (Hoeschst-33342), vert (Annexine V-FITC) et rouge (PI) du NucleoCounter® NC-3000™. Les flèches indiquent les quatre populations différentes présentes dans les échantillons. Le grossissement optique de l’instrument est ×2.

 

Visualiser l’ensemble de données dans l’affiche PDF.

Conclusion

« Nous avons utilisé un cytomètre en image, le NucleoCounter® NC-3000™, pour quantifier différents événements du processus apoptotique. Comparé à la cytométrie en flux (BD LSRII), le NC-3000™ a démontré une détermination précise et rigoureuse de la translocation de la phosphatidylsérine, de l’activation de la Caspase 3/7 et de la dépolarisation du potentiel de la membrane mitochondriale. »
Olaf Nielsen, professeur à l’Université de Copenhague.

Actuellement, la cytométrie en flux est la méthode de référence en matière de collecte d’informations quantitatives sur de grandes populations cellulaires. Dans cette étude, nous avons comparé un cytomètre en image, le NucleoCounter® NC-3000™ et un cytomètre en flux, BD LSRII, pour la quantification de différents événements du processus apoptotique.

Dans le cadre de notre étude comparative, nous avons mesuré l’externalisation de la phosphatidylsérine, l’effondrement du potentiel de la membrane mitochondriale et l’activation de la Caspase 3/7, qui sont tous des marqueurs bien connus d’apoptose cellulaire.

Lorsque nous avons comparé le NC-3000™ au BD LSRI, nous avons constaté que le premier a quantifié de manière précise et rigoureuse les cellules apoptotiques en présence des trois marqueurs. Nous avons constaté un degré élevé de concordance entre les fractions de cellules apoptotiques mesurées par les deux systèmes cytométriques.

En bref, le cytomètre en image NC-3000™ est une nouvelle technologie qui permet d’analyser de manière précise et fiable les moindres altérations de l’homéostasie cellulaire au sein de grandes populations. Contrairement à la cytométrie en flux conventionnelle, le NC-3000™ permet à l’utilisateur de valider l’échantillon par inspection visuelle des cellules individuelles.

Auteurs

Olaf Nielsen, Anna Fossum et Soren Kjaerulff.