Phénotypage rapide pour la caractérisation des maladies héréditaires au moyen de la cytométrie par analyse d'images

Caractérisation à des fins de thérapie génique à l'hôpital universitaire d'Aarhus

Le phénotypage des cellules de patients atteints de maladies héréditaires peut être un outil extraordinaire pour comprendre divers aspects d’une maladie, y compris son étiologie. À l’Université d’Aarhus, Fernandez et ses collègues ont développé un nouveau protocole de phénotypage cellulaire au moyen du cytomètre en image avancé NucleoCounter® NC-3000™ pour caractériser les paramètres cellulaires et mitochondriaux dans les fibroblastes dermiques humains (FDH)1. Les auteurs utilisent les FDH comme modèle pour développer le nouveau protocole de phénotypage cellulaire.

Pour valider ce modèle dans des échantillons provenant de patients, ils utilisent des FDH issus de patients qui présentent un déficit en acyl-coenzyme A déshydrogénase des acides gras à chaîne très longue (VLCADD) et la lignée cellulaire FDHN comme contrôle. L’altération du gène VLCAD entraîne un échec de la β-oxydation des acides gras qui provoque à son tour une augmentation des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et un dysfonctionnement mitochondrial. Les patients atteints de VLCADD présentent de nombreux symptômes, selon la gravité de la maladie.

Le protocole proposé par Fernandez permet de gagner du temps et ne nécessite que de petites quantités de tissus pour chaque analyse. Cette même approche peut être utilisée pour développer d’autres protocoles de phénotypage cellulaire pour l’analyse de paramètres personnalisés.

Pour un échantillon, trois paramètres analysés au moyen de tests rapides et faciles à réaliser

Les auteurs se servent du NucleoCounter ® NC-3000™ pour étudier trois paramètres des FDH :

  1. Nombre et viabilité des cellules

Le protocole de Comptage et l’étude de viabilité cellulaires fournit des informations sur le nombre et la viabilité des cellules. Il est réalisé en deux étapes :

  1. Pour déterminer la concentration cellulaire totale, les cellules sont lysées, puis colorées au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), de sorte que tous les noyaux deviennent fluorescents.
  2. Le nombre de cellules viables est déterminé en ajoutant du DAPI directement à des échantillons non traités et en procédant à leur quantification. Puisque le DAPI ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire intacte, seules les cellules mortes dont la membrane est compromise présentent une coloration au DAPI.

La viabilité est calculée par la formule suivante :     Viabilité en % = (nombre total de cellules – nombre de cellules mortes)/nombre total de cellules × 100.

  1. État redox global des cellules

L’étude de viabilité cellulaire fournit des informations sur l’état redox des thiols dans les cellules, et par conséquent de l’état redox global, puisque les processus sont liés. Ce test utilise VitaBright-48™, un fluorophore à perméabilité cellulaire qui devient fluorescent lorsqu’il réagit avec les groupements thiols réduits des protéines.

  1. Mesure du potentiel de la membrane mitochondriale

La Mesure du potentiel de la membrane mitochondriale évalue le potentiel de la membrane mitochondriale (PMM), crucial pour plusieurs aspects de la fonction mitochondriale, et fournit donc des informations sur l’intégrité mitochondriale de l’ensemble des cellules. Cette mesure est réalisée par le JC-1, un fluorophore qui émet dans le rouge lorsqu’il forme des agrégats dans les mitochondries des cellules saines et qui émet dans le vert lorsqu’il est dispersé dans le cytosol des cellules apoptotiques.

Tests prêts à l’emploi pour les paramètres de phénotypage avec le NucleoCounter® NC-3000™

Le diagramme représente le protocole de phénotypage faisant l’objet de l’article de Fernandez 2. Puisque les étapes de préparation initiales sont les mêmes pour les trois tests, il faut préparer un seul échantillon.

Environ 1,6 × 10 6 FDH sont ensemencés dans un flacon de culture cellulaire T75 standard. Après 24 heures, les FDH sont traités avec 0, 2 ou 4 mmol/l H 2 O 2 pendant 1, 1,5 et 2 heures, respectivement. Ensuite, les FDH sont récoltés par trypsinisation et collectés dans un tube à échantillon Falcon de 15 ml. Quatre aliquotes sont prélevées en vue du comptage et de l’étude de viabilité cellulaire, de la détermination de l’état redox des groupements thiols et l’évaluation de la fonction mitochondriale. Ensuite, elles sont colorées selon les protocoles de dosage individuels.

Les échantillons sont analysés à l’aide du NC-Slide A2™ suivant des protocoles standard pour le NucleoCounter® NC-3000™.

Validation du protocole de phénotypage cellulaire avec des échantillons de tissus FDH

Pour valider le protocole de phénotypage cellulaire, des échantillons de tissus FDH provenant de patients VLCADD sont traités avec H 2 O 2 et évalués.

Le stress oxydatif constitue une agression pour les cellules et le traitement au H2O2 réduit à la fois le nombre de cellules et leur viabilité (A)2. Cela est corrélé à une forte diminution de l’intensité moyenne de fluorescence (IFM) de VitaBright-48™, à savoir la quantité de thiols réduits (Image B). Cela est normal car H2O2 provoque une oxydation intracellulaire. Le traitement par H2O2 induit également une augmentation marquée du nombre de cellules qui ont perdu leur potentiel de membrane mitochondriale, mesuré par l’IFM du JC-1 (C), ce qui suggère une perte de la fonction mitochondriale et l’initiation de l’apoptose des cellules traitées par H2O2.

Les tests NC-3000™ sélectionnés pour ce protocole de phénotypage cellulaire identifient donc avec précision les changements cellulaires et mitochondriaux dans une situation reproduisant les conditions physiopathologiques avec des niveaux de ERO élevés.

Phénotypage cellulaire des FDH à partir d'échantillons provenant de patients VLCADD

Ensuite, Fernandez et son équipe testent la réponse des FDH de patients souffrant d’une forme légère ou sévère de VLCADD. Une concentration élevée de H2O2 entraîne une diminution significative de la viabilité des fibroblastes des patients atteints des deux formes de la maladie par rapport au témoin. Cela donne à penser que les cellules qui présentent un déficit en VLCAD sont plus sensibles au stress oxydatif. Il est intéressant de noter que, tel qu’il est évalué au moyen du test de vitalité cellulaire, il n’y a pas de différence d’état redox intracellulaire entre les fibroblastes sains et les fibroblastes malades.

Par rapport au groupe témoin, les fibroblastes provenant de patients atteints de la forme bénigne de la maladie montrent une augmentation du nombre de cellules perdant leur PMM. En conclusion, ce protocole de phénotypage cellulaire peut identifier les similitudes et les différences en réponse au stress oxydatif des FDH sains et malsains, ce qui en fait une méthode très efficace pour surveiller la fonction mitochondriale dans les FDH des patients VLCAD.

Utilisation de la cytométrie en images pour développer de nouveaux protocoles de phénotypage cellulaire

Le NucleoCounter®NC-3000™ est livré avec plusieurs tests de dosage de l’apoptose supplémentaires, un test d’analyse de cycle cellulaire et un module personnalisable appelé FlexiCyte ™ pour analyser jusqu’à quatre biomarqueurs fluorescents définis par l’utilisateur. N’importe lequel de ces tests prêts à l’emploi peut être incorporé, au besoin, dans d’autres phénotypages cellulaires selon les besoins. Les protocoles de phénotypage cellulaire utilisant le NC-3000™ vous permettent de préparer un seul échantillon et ainsi de gagner du temps. En outre, un volume moindre d’échantillon est requis pour chaque expérience de phénotypage.

Références

  1. P Fernandez-Guerra, M Lund, TJ Corydon et al.: Application of an Image Cytometry Protocol for Cellular and Mitochondrial Phenotyping on Fibroblasts from Patients with Inherited Disorders. JIMD Rep. 2016; 27:17-26.
  2. Open access to publication and figures through ResearchGate.