Une comparaison de la quantification de l'ADN lors des différentes phases du cycle cellulaire

Recherche en biologie cellulaire à l'Université de Copenhague

L’approche la plus courante pour déterminer la phase du cycle cellulaire est basée sur la quantification de la teneur en ADN cellulaire. Celle-ci peut être déterminée à l’aide de colorants fluorescents sélectifs à l’ADN qui produisent des signaux d’émission proportionnels à la masse d’ADN présente. La coloration de l’ADN est généralement effectuée sur des cellules perméabilisées avec des détergents non ioniques ou en ayant recours à une fixation à l’alcool. La cytométrie en flux a longtemps été la méthode habituellement privilégiée pour procéder à l’analyse de la distribution du cycle cellulaire.

Le cycle cellulaire constitue le processus le plus fondamental et le plus important chez les cellules eucaryotes. Se décomposant en un ensemble ordonné d’événements, qui aboutissent à la croissance cellulaire et à la division en deux cellules filles, le cycle cellulaire est étroitement régulé par une expression temporelle et spatiale définie, ainsi que par la localisation et la destruction de plusieurs régulateurs. Les cyclines et les kinases dépendantes des cyclines (CDK) sont des commutateurs de contrôle majeurs lors du cycle cellulaire. Elles provoquent le passage de la cellule de la phase G1 à S ou de G2 à M.

Dans chaque population, les cellules se répartissent entre les trois phases principales du cycle cellulaire : la phase G1/G0 (un ensemble de chromosomes appariés par cellule) ; la phase S (synthèse d’ADN avec une quantité variable d’ADN) et la phase G2/M (deux ensembles de chromosomes appariés par cellule, avant la division cellulaire).
La progression et la régulation du cycle cellulaire peuvent être étudiées de différentes manières. Ici, nous présentons une étude comparative entre la cytométrie en image et celle en flux, basée sur l’utilisation de cellules perméabilisées par fixation d’alcool ou lyse acide.

Comparaison de la détermination de la teneur en ADN par la cytométrie en image par rapport à celle en flux

Les cellules Jurkat, CHO et U2OS en croissance exponentielle ont été perméabilisées par fixation à l’alcool, colorées avec du DAPI et analysées pour déterminer leur teneur en ADN par cytométrie en flux (rangée supérieure) et cytométrie en image (rangée inférieure). Les données acquises ont été analysées comme décrit dans la section Méthodes de l’affiche au format PDF. Les zones verte, jaune et bleue des histogrammes représentent les cellules pendant les phases G1, S et G2/M, respectivement.

Pour les trois lignées cellulaires, les histogrammes représentant la teneur en ADN mesurée avec le cytomètre en image ressemblent à ceux acquis avec le cytomètre en flux. Dans tous les cas, les histogrammes affichent des pics G1 étroits avec un faible coefficient de variance (CV).

Voir l’ensemble de données dans l’affiche au format PDF

Conclusion

La dérégulation du cycle cellulaire constitue une caractéristique distinctive des cellules cancéreuses et de nombreux médicaments chimiothérapeutiques ciblant la progression du cycle cellulaire. Pour effectuer une analyse fiable du cycle cellulaire et pour détecter des anomalies génomiques, telles que l’aneuploïdie, il est nécessaire d’avoir recours à des systèmes fournissant une quantification exacte et précise de la teneur en ADN. Actuellement, la cytométrie en flux est l’étalon-or pour quantifier la teneur en ADN cellulaire.

Dans cette étude, nous avons établi que, comparé au BD LSR II, le NucleoCounter® NC-3000™ fournit des résultats d’une grande exactitude et précision lors de la quantification de la teneur en ADN cellulaire. Nous avons ainsi observé un degré élevé de concordance entre les distributions du cycle cellulaire mesurées par les deux systèmes cytométriques.

De plus, nous avons comparé deux méthodes différentes de perméabilisation des cellules avant la coloration de l’ADN : La fixation à l’aide d’alcool conventionnelle et la combinaison d’acide doux et de détergent non ionique. Les résultats présentés montrent que la nouvelle méthode de lyse acide permet d’obtenir une quantification précise de la teneur en ADN. Dans l’ensemble, les cellules lysées à l’aide d’acide ont fourni un coefficient de variation (CV) du pic G1 plus fiable que les cellules fixées avec de l’alcool.

En conclusion, les distributions du cycle cellulaire quantifiées par cytométrie en image sont exactes et précises comparées à celles obtenues par la cytométrie en flux. De plus, le recours à cette méthode présente des avantages en matière de rentabilité, de fiabilité et de potentiel de confirmation morphologique des objets mesurés.

Auteurs

Olaf Nielsen, Anna Fossum et Soren Kjaerulff.