Cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Déterminer efficacement la viabilité et le nombre de cellules souches destinées à la greffe

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules multipotentes isolées en grande partie dans la moelle osseuse mais qui se trouvent également dans le sang du cordon ombilical et dans les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC). Les CSH ont été les premières cellules reconnues comme cellules souches et les premières à avoir été utilisées en tant que progénitrices des cellules sanguines dans le fonctionnement du système immunitaire1. Le CD34 est le principal marqueur les identifiant comme cellules multipotentes et d’origine hématopoïétique.

Les cellules souches hématopoïétiques/progénitrices (HSPC) sont souvent utilisées pour la greffe allogénique ou autologue dans le cadre du traitement des cancers du sang ou des os, tels que la leucémie et le myélome. Ici, les CSH sont utilisées pour la thérapie par remplacement cellulaire, celles-ci étant prélevées directement des tissus d’un donneur qui a le HLA correspondant et greffées à un patient atteint de leucémie afin de remplacer les cellules malades.

Les HSPC sont également isolées et différenciées en cellules plus matures de la lignée sanguine pour servir d’alternative aux matériaux provenant du patient, par exemple pour les transfusions et les solutions de plaquettes isolées, utilisées lors d’interventions chirurgicales ou d’autres types de traitements. Dans les banques du sang de cordon ombilical, les HSPC sont isolées à partir du cordon ombilical des nouveau-nés et conservées pour une éventuelle utilisation future dans le cadre d’un traitement destiné au donneur lui-même ou à ses proches. Mais elles constituent également une ressource à disposition de la recherche sur la différenciation et l’utilisation potentielle des HSPC dans de nouveaux traitements.

Grâce aux progrès de l’édition génomique, dont un exemple bien connu est le système CRISPR/Cas9, les cellules souches/progénitrices hématopoïétiques (HSPC) sont utilisées pour traiter et vaincre les maladies génétiques telles que la drépanocytose2 et, en particulier, dans l’immunothérapie cellulaire par lymphocytes B. Les cellules T et NK sont utilisées pour générer des récepteurs d’antigènes chimériques (CAR) pour traiter les cancers.

Pour répondre à de nombreuses applications, les cellules HPSC doivent être très souvent isolées et maintenues dans leur état de pluripotence afin de pouvoir proliférer sans se différencier de manière spontanée. La maturation ultérieure des cellules sanguines ou toute autre différenciation ultérieure ou leur manipulation doit suivre une multitude de protocoles.

Selon tous les protocoles, la quantification de la population cellulaire initiale ou de celle qui est manipulée ainsi que l’identification de leurs marqueurs génétiques et de leur état de pluripotence ont une importance cruciale pour obtenir des résultats satisfaisants, valider le potentiel d’un nouveau traitement et prédire des effets thérapeutiques.

Les défis du comptage et de mesure de la viabilité des HSC

Tous les échantillons de moelle osseuse et les échantillons de sang complet contiennent des globules rouges (GR), des plaquettes et des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) comprenant des leucocytes, des cellules souches mésenchymateuses (CSM) et des CSH (uniquement dans la moelle osseuse et dans le sang périphérique). Le comptage cellulaire et la mesure de la viabilité des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) fraîchement isolées constituent une tâche difficile car l’échantillon contient encore des globules rouges. En effet, les compteurs de cellules automatisés basés sur la technique du champ clair ont une capacité limitée à distinguer les PBMC des globules rouges.

Solutions pour travailler avec les HSC

Pour quantifier et évaluer la viabilité de la population cellulaire totale d’échantillons de cordon ombilical ou de moelle osseuse, le NucleoCounter® NC-200™ ne compte que les PBMC et exclut les globules rouges et les plaquettes, car ils ne sont que faiblement colorés. Concernant la totalité des échantillons de sang complet, le NucleoCounter® vous permet de mesurer la Viabilité et d’assurer le comptage cellulaire – Dosage sanguin en présence d’une concentration très élevée de globules rouges.

L’utilisation d’un tampon de lyse permet une lyse des globules rouges visant à minimiser l’effet d’extinction de l’hémoglobine et à assurer une coloration intense des PBMC à l’acridine orange et au DAPI qui détecteront respectivement l’ensemble de la population cellulaire et les cellules mortes. L’absence du noyau et, par conséquent, la faible coloration, empêche la détection des plaquettes. Le logiciel NucleoView ™, que nous fournissons, permet à l’utilisateur de s’assurer que toutes les cellules ont été comptées correctement.

Si vous devez réaliser une analyse complète des marqueurs cellulaires et des données en matière de comptage et viabilité, le NucleoCounter® NC-3000™ dispose d’un test de marquage flexible, le FlexiCyte™, qui vous permet de colorer jusqu’à deux échantillons différents à la fois par plusieurs marqueurs selon les protocoles définis par l’utilisateur et les paramètres d’analyse à régler avant et après l’acquisition des données.

Références

  1. JE Till and EA McCulloch: A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res. 1961; 14, 213–222.
  2. MA DeWitt, W Magis, NL Bray et al.: Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Transl Med. 2016; 8(360):360ra134.

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