Cellules souches pluripotentes induites (iPSC)

Un comptage cellulaire rigoureux pour une différenciation réussie en médecine régénérative

Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des cellules souches pluripotentes générées à partir de cellules somatiques. Développé par le laboratoire de Shinya Yamanaka en 2006 (souris iPSCs1) et en 2007 (iPSCs humains2), ce type de cellule a révolutionné la recherche dans le domaine des cellules souches pluripotentes. En effet, les iPSC permettent aux chercheurs de mener à bien des expériences sur des cellules souches provenant de différents contextes génétiques. En outre, avant l’introduction des iPSC, les recherches sur les cellules souches étaient réalisées sur les cellules souches embryonnaires (CES) provenant de tissus embryonnaires humains. En effet, l’utilisation des CES soulève des préoccupations éthiques concernant la dérivation et la culture des cellules. C’est pour cela qu’elle est illégale ou sujette à restrictions dans de nombreux pays. L’introduction des iPSC a été la solution à la plupart des préoccupations éthiques liées à l’utilisation des cellules embryonnaires. Les iPSC ont alors été adoptées par les scientifiques du monde entier.

Génération, culture et différenciation des iPSC

De nouvelles lignées d’iPSC sont générées en continu par surexpression des quatre « facteurs Yamanaka », à savoir Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc dans les cellules somatiques, ce qui les transforme en iPSC. Grâce à cela, nous pouvons rechercher un potentiel de différenciation relatif à différents contextes génotypiques. L’étude de la relation entre origine génétique et expression phénotypique fournit des informations sur l’évolution de la maladie et sur une pharmacothérapie potentielle.

Traditionnellement, les iPSC sont cultivées sur des cellules nourricières dans un milieu contenant du sérum bovin dans un système de culture bidimensionnelle. Aux fins d’un développement contrôlé d’une niche de cellules souches, les paramètres de culture ont évolué vers des conditions de plus en plus restreintes. À ce titre, les composants ne doivent pas contenir de sérum, doivent être exemptes de xeno-contaminants, et des lames en plastique remplacent les supports d’attache pour les cellules. Un environnement restreint améliore les conditions de culture de la niche des cellules souches et favorise une différenciation dirigée vers le type souhaité de cellules progénitrices ou de cellules matures : Il en découle un meilleur contrôle des voies de signalisation cellulaire par les facteurs de croissance et les inhibiteurs entraînant la différenciation dirigée d’intérêt.

Les progrès récents dans le domaine ont permis de passer d’une culture de cellules souches dans des systèmes de culture bidimensionnelle à des systèmes tridimensionnels plus pertinents d’un point de vue physiologique. Un exemple est la culture des sphéroïdes et des organoïdes permettant une signalisation et des interactions cellulaires appropriées pendant les phases de croissance et de différenciation. Ces cultures en 3D sont très prometteuses dans le cadre de la découverte de nouveaux médicaments et dans celui de la médecine régénérative. En effet, grâce à ces cultures, les chercheurs peuvent mieux réussir les tests de simulation de l’impact des traitements sur les tissus dans le cadre d’une croissance pertinente du point de vue physiologique (la niche des cellules souches) et non pas uniquement dans des couches cellulaires isolées.

De façon prédominante, ce sont les organoïdes intestinaux fabriqués par Toshiro Sato et Hans Clevers3 qui ont été utilisés pour le criblage et la conception de médicaments offrant de meilleures options de traitement de la fibrose kystique4. Les organoïdes cérébraux ont été introduits initialement par Madeline Lancaster5. Ils favorisaient la différenciation des iPSC en différents types cellulaires et zones du cerveau et permettaient, par exemple, de réaliser une modélisation complexe de certaines maladies comme la microcéphalie et des tests médicamenteux.

Quel est le défi ?

Outre les milieux de culture, les revêtements et le niveau de pluripotence des cellules avec lesquelles vous travaillez, la densité cellulaire représente le quatrième facteur majeur qui contribue à la réussite d’une expérience. La signalisation intercellulaire est difficile à contrôler et à manipuler, mais l’ensemencement des cellules à la bonne concentration peut largement contribuer à l’obtention de la différenciation dirigée en cellules d’intérêt. Par exemple, les protocoles de différenciation en types cellulaires mésodermiques et endodermiques telles que, entre autres, les cellules cardiaques, ont montré que de faibles densités cellulaires affectent positivement les pourcentages de cellules d’intérêt 6,7. De plus, de faibles densités cellulaires se traduisent par des concentrations inférieures en cytokines pour obtenir le même effet. Cela constitue un avantage supplémentaire puisqu’il permet de réduire les coûts relatifs à l’étape de culture tissulaire.

Inversement, les protocoles de différenciation neuronale nécessitent souvent des densités cellulaires élevées, car la signalisation cellulaire est indispensable et la densité cellulaire en début de culture détermine le ratio entre, par exemple, les cellules progénitrices du système nerveux central et celles des crêtes neurales 8,9.

Le maintien de cultures de iPSC est réalisé en faisant passer les agrégats de cellules de taille moyenne (agrégats) sur un tamis cellulaire, ce qui évite le ré-étalement sur la surface. De cette manière, la régulation de la niche de iPSC n’est pas trop perturbée durant le tamisage.

Méthodes de travail avec les iPSC

Lors du lancement de la différenciation des iPSC pluripotentes, le comptage cellulaire pour réaliser l’ensemencement est une opération fastidieuse et assez imprécise : C’est chronophage et la dissociation complète des cellules du milieu de culture peut s’avérer difficile. Se fier à un comptage de cellules agrégées est une méthode inexacte puisque la taille des agrégats est variable et, par conséquent, le nombre total de cellules aussi. Au mieux, seule une estimation est possible. Le NucleoCounter® NC-202™ vous permet de réaliser une dissociation directe des agrégats lors du comptage grâce au test dénommé Aggregated Cell Count Assay (numération des cellules agrégées) et d’effectuer un comptage cellulaire précis vous permettant également de connaître le pourcentage de viabilité en deux minutes seulement.

Le NC-202™ ne procède pas à une dissociation complète en cellules individuelles mais il compte les noyaux des cellules vivantes et ceux des cellules mortes en se basant sur l’émission de fluorescence. De cette manière, l’instrument peut mieux discerner les cellules individuelles qui forment de petits agrégats puisqu’il y a moins de chevauchement entre les noyaux de cellules des agrégats que lorsqu’on utilise les compteurs de cellules automatisés basés sur l’imagerie en champ clair.

La Via2-Cassette™ élimine les biais d’utilisateur et vous évite de manipuler les réactifs de coloration de cellules car ils sont incorporés dans la cassette. Calibrée individuellement en volume, la Via2-Cassette™ contribue à la solidité du NC-202™ et vous garantit des variations intraspécifiques faibles et un taux élevé de réussite de différenciation cellulaire. De plus, cet instrument est conforme à la norme 21 CFR Part 11 et peut donc intégrer les protocoles exigeant la conformité aux BPF.

Nos ingénieurs d’applications terrain (FAS) mettent leur expertise à disposition de tous nos clients en leur offrant une assistance à l’utilisation des instruments. Nos FAS se rendent auprès des laboratoires et proposent également des démonstrations en ligne d’utilisation des instruments. Ils seront prêts à discuter avec vous sur vos méthodes de comptage des iPSC. Lors de l’installation, un FAS assurera la formation du personnel pour l’utilisation de l’instrument. Il effectuera des tests de qualité pour vous garantir une installation réussie. Grâce à notre régime d’assurance-services, vous pouvez prolonger la garantie du produit. Quant à nous, nous effectuerons des visites d’entretien régulières afin de valider les performances de l’instrument et former votre équipe.

Références

  1. K Takahashi and S Yamanaka: Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 2006; 126, 663–676.
  2. K Takahashi, K Tanabe, M Ohnuki et al.: Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 2007; 131, 861–872.
  3. T Sato and H Clevers: Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 2013;340(6137):1190-4.
  4. SF Boj, AM Vonk, M Statia et al.: Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. 2017;(120):55159
  5. MA Lancaster, M Renner, C-A Martin et al.: Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501(7467):373-9.
  6. MNT Le, M Takahi, K Maruyama et al.: Cardiac differentiation at an initial low density of human-induced pluripotent stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2018;54(7):513-522.
  7. H Ninomiya, K Mizuno, R Terada et al.: Improved efficiency of definitive endoderm induction from human induced pluripotent stem cells in feeder and serum-free culture system. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2015. 51(1):1-8.
  8. S Srimasorn, M Kirsch, S Hallmeyer-Ellgner et al.: Increased Neuronal Differentiation Efficiency in High Cell Density-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Int. 2019. Volume 2019 |Article ID 2018784.
  9. SM Chambers, CA Fasano, EP Papapetrou et al.: Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 2009. 27(3):275-80.

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