Comptage cellulaire et mesure de la viabilité des cellules agrégées

Les colorants fluorescents colorient les noyaux des cellules au sein d’agrégats, de sphéroïdes et sur microporteurs

Les instruments NucleoCounter® vous offrent des solutions solides et fiables pour le comptage des cellules en amas et agrégats. Ils utilisent des agents fluorescents pour colorer les noyaux cellulaires et un puissant algorithme pour segmenter les noyaux uniques au sein des plus petits agrégats

Pour les échantillons plus fortement agrégés, une estimation numérique du niveau d’agrégation cellulaire permet à l’opérateur de décider  de passer éventuellement au test spécifique de dosage de cellules agrégées qui désassemble les cellules en passant par une étape de lyse. Ce test est également utilisé pour compter les cellules cultivées sur microporteurs ou au sein de sphéroïdes.

Microscopie à fluorescence et optique pour le comptage des cellules au sein d’agrégats

La microscopie optique met en évidence le contour des objets en fonction de leur type de coloration. Le comptage cellulaire à l’aide des méthodes conventionnelles de la microscopie optique peut comporter des contaminations et l’introduction de débris cellulaires visuellement impossibles à distinguer des cellules. Mais surtout, lorsque les membranes cellulaires accolées se chevauchent, comme dans les amas cellulaires, il est quasiment impossible d’identifier avec précision les cellules individuelles.

Les instruments NucleoCounter® se servent de l’acridine orange (AO) et du DAPI, deux colorants fluorescents ayant une affinité pour l’ADN, pour marquer les noyaux cellulaires avec une grande spécificité et pour générer un contraste élevé entre les signaux. Les noyaux sont plus petits que les cellules dans leur intégralité et il est donc préférable de les segmenter lorsqu’on travaille avec de petits agrégats. De plus, les débris cellulaires et autres artefacts, qui seraient autrement visibles par microscopie optique, se révèlent indétectables par microscopie à fluorescence.

Les artefacts visibles au moyen de la technologie de la microscopie optique, comme le champ clair, ne le sont plus lorsque des filtres à fluorescence sont utilisés. La coloration AO se traduit par une amélioration du signal émanant des noyaux, rendant ainsi plus facile l’identification des cellules individuelles au sein des agrégats.

Principe de l'analyse d'images automatisée à l’aide du logiciel NucleoCounter®

NC-View™ et NucleoView™ sont les plates-formes logicielles des instruments NucleoCounter® NC-202™ et NucleoCounter ® NC-200™, respectivement. Le logiciel utilise un algorithme puissant pour identifier et analyser avec précision les cellules individuelles au sein d’agrégats plus petits.
Les cellules accolées présenteront toujours des pics discrets bien identifiables, même lorsque leurs pentes se chevauchent.

Les images acquises au moyen de l’instrument NucleoCounter® sont instantanément traitées par le puissant algorithme du logiciel. Les pics et les pentes d’intensité sont utilisés pour segmenter les cellules individuelles, y compris celles au sein des agrégats.

Les données sont affichées sous forme d’images fluorescentes afin que l’utilisateur puisse distinguer les cellules vivantes des mortes et les compter. À l’aide de NucleoCounter® NC-3000™, vous pouvez également afficher les données sous forme d’histogramme avec la possibilité de régler les paramètres seuils pour une analyse plus approfondie. Cela permet à l’utilisateur de remonter aux cellules individuelles et aux populations cellulaires.

Les instruments NucleoCounter® donnent une estimation numérique de l'agrégat cellulaire

Le système NucleoCounter® vous offre des performances supérieures de segmentation des cellules au sein de petits agrégats de moins de cinq cellules. Les échantillons qui présentent de plus gros agrégats ont tendance à avoir des cellules qui se chevauchent et cela rend ces échantillons très difficiles à analyser. Effectivement, le comptage cellulaire manuel et automatisé par les moyens technologiques de microscopie optique, telles que la microscopie en champ clair et le contraste de phase, ne permet pas d’estimer les niveaux d’agrégation des échantillons.

Par les instruments NucleoCounter® l’opérateur obtient une estimation du pourcentage d’agrégation de l’échantillon et, partir de cela, il peut décider  de se servir du test spécifique de comptage des cellules agrégées qui lui permettra d’en déterminer le nombre de cellules.

Comptage de cellules ou d’agrégats fortement agrégés

Les échantillons de tissus et certains types cellulaires cultivés au sein de sphères ou sur microporteurs, tels que les MCF-7, HepG2 et iPSC, ont tendance à former de gros amas résistant aux méthodes de séparation enzymatiques ou mécaniques. Les cellules individuelles présentes dans de si grands agrégats sont sujettes à une surexposition et cela réduit l’exactitude et la précision du comptage cellulaire.

Les logiciels NC-View™ et NucleoView™ donnent le pourcentage de cellules d’agrégats de plus de cinq cellules. Cela permet de repérer les échantillons où une agrégation de cellules se produit et pourrait affecter le comptage. Le test spécifique de comptage de cellules agrégées est recommandé pour ce type d’échantillons. Ce test détermine le nombre total de cellules à partir d’une aliquote séparée par un processus de lyse de l’échantillon. La lyse désintègre la membrane cellulaire, démantèle les amas et libère les noyaux qui seront colorés par la solution. Puisque les cellules mortes sont généralement moins nombreuses et ont tendance à se séparer des agrégats, leur comptage peut toujours se baser sur l’aliquote non lysée.