Pourquoi travailler avec du bleu de trypan n'est pas une bonne idée

Vérification de la précision de la numération et de la détermination de la viabilité cellulaire au bleu de trypan

Pendant des décennies, on a eu recours au bleu de trypan pour colorer les cellules comptées par la microscopie en champ clair pour estimer leur viabilité. Cette méthode se base sur le test d’exclusion de colorant pour la viabilité des cellules : Le bleu de trypan ne parvient pas à pénétrer dans la membrane des cellules viables, imperméable à ce colorant, mais pénètre dans celle des cellules mortes.

Malheureusement, après un temps d’exposition de cinq minutes seulement, le bleu de trypan commence à devenir toxique pour les cellules1-3. Avec le temps, les cellules viables sont également colorées au bleu de trypan car lorsque le colorant pénètre dans leur membrane cellulaire, elles finissent par mourir (généralement, entre 5 et 30 minutes après l’exposition). La toxicité du bleu de trypan impacte la précision des mesures de deux manières : (i) l’analyse de viabilité change au fil du temps, et (ii) la viabilité d’une population cellulaire est sous-estimée2.

Des méthodes alternatives et plus précises existent

On utilise la microscopie en champ clair pour valider et quantifier les cultures cellulaires. Cette méthode donne des colorations ambiguës et se base sur une série de paramètres, tels que la rondeur et l’uniformité pour distinguer les cellules d’autres particules. Le bleu de trypan colorie les cellules mortes dans des tons allant du bleu clair au noir selon la viabilité globale de la culture cellulaire. Lorsqu’on utilise la microscopie en champ clair, les cellules très légèrement colorées au bleu de trypan peuvent être difficiles à différencier des cellules non colorées, et donc difficiles à identifier. À cela s’ajoute le fait que les membres individuels du laboratoire auront chacun une vision quelque peu subjective de ce qu’est une cellule morte et de ce qu’est une cellule vivante. Par conséquent, l’utilisation du bleu de trypan pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes introduit le risque de variabilité entre différents utilisateurs et instruments.

C’est pour ces raisons que le dosage fluorimétrique est considéré comme une meilleure méthode d’évaluation de la viabilité cellulaire que les dosages colorimétriques tels que celui au bleu de trypan4. Comme les cellules possèdent une quantité d’ADN/ARN relativement stable, l’acridine orange (AO) et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), qui sont des colorants fluorescents, interagissent avec l’ADN en produisant une coloration uniforme qui permet de quantifier les cellules alors que la méthode en champ clair produit une coloration non-spécifiée. L’AO est perméable à la membrane et colorie la population cellulaire totale, tandis que le DAPI ne colorie que la population de cellules mortes. Par conséquent, la détermination fluorimétrique de la viabilité cellulaire à l’AO et au DAPI garantit une précision supérieure dans l’identification des cellules vivantes et des cellules mortes avec un bruit et une variation réduits.

La sécurité est importante !

Garantir un environnement de travail sûr est essentiel pour les entreprises. Selon l’Agence européenne des produits chimiques (ECHA), le bleu de trypan peut provoquer des cancers, des anomalies génétiques et nuire à la fertilité ou à l’enfant à naître5. Par conséquent, des précautions particulières doivent être prises pour éviter d’exposer les opérateurs au bleu de trypan lors de l’utilisation et l’élimination du colorant.

Un autre facteur important à prendre en considération lors de la manipulation du bleu de trypan est qu’il est classé comme cancérigène du groupe 2B (ECHA5). Cela rend le travail avec le bleu de trypan potentiellement dangereux pour les opérateurs du laboratoire puisque l’exposition doit être évitée lorsque cela est possible.

Il existe des alternatives de comptage cellulaire sûres qui offrent une précision accrue et une exactitude supérieure.

Conservation sous clé dans les laboratoires de l'UE

L’ECHA a récemment apporté des modifications visant à souligner le fait que le bleu de trypan est toxique pour l’homme et à limiter son utilisation. En le classant comme cancérigène, son objectif est de motiver les utilisateurs à progressivement éliminer l’utilisation du bleu de trypan dans les laboratoires européens 5. En mars 2021, cette classification a déjà conduit des pays comme le Danemark à exiger des laboratoires qu’ils détiennent un permis pour pouvoir utiliser du bleu de trypan. Ce permis ne peut leur être délivré que si son utilisation est strictement nécessaire dans leur processus de travail 6, 7. Par ailleurs, les titulaires de permis sont tenus de limiter l’exposition des professionnels de laboratoire au bleu de trypan en leur garantissant un environnement de travail sûr en créant des procédures d’exploitation normalisées (SOP) pour tous les processus de travail dans le cadre desquels le bleu de trypan est utilisé. Cette démarche consiste notamment à s’assurer que tous les échantillons et consommables exposés au bleu de trypan sont collectés et éliminés séparément des déchets de laboratoire normaux.

Même si, pour le moment, ces règles ne s’appliquent pas aux pays situés en dehors de l’Europe, une grande partie de la communauté scientifique s’accorde sur l’existence de risques associés au bleu de trypan 5, ce qui implique que son utilisation doit être limitée, car il peut causer de graves dommages aux utilisateurs.

Alternatives au bleu de trypan

Les alternatives au bleu de trypan comprennent l’AO et le DAPI qui ne sont pas cancérigènes 8, 9. Leur utilisation en tant qu’alternatives au bleu de trypan peut contribuer à la création d’un environnement de travail plus sûr. Dans la mesure où la Via2-Cassette™ encapsule ces colorants, sa conception garantit l’élimination de tout contact de l’utilisateur avec eux. Cette technologie de cassette peut facilement être mise en place comme mesure de sécurité dans les laboratoires du monde entier.

La Via2-Cassette™ est un dispositif microfluidique unique qui fournit une numération cellulaire d’une précision et d’une exactitude inégalées et élimine l’exposition de l’utilisateur aux produits chimiques. La Via2-Cassette™ comprend une pipette intégrée qui prévient les erreurs lors du pipetage et de la coloration. Les colorants fluorescents AO et DAPI sont immobilisés à l’intérieur des canaux de la cassette, ce qui permet la coloration automatique de la population cellulaire totale et celle des cellules mortes, respectivement. Tout au long du processus de numération cellulaire, l’AO et le DAPI restent à l’intérieur du dispositif microfluidique, ce qui réduit considérablement le risque d’exposition. La Via2-Cassette ™ est éliminée après chaque utilisation, ce qui contribue à maintenir un environnement de travail sûr.

La Via2-Cassette™ s’utilise avec le NucleoCounter® NC-202™, un compteur de cellules fluorescentes automatisé qui fournit une analyse de la totalité des cellules et des cellules vivantes, de la concentration en cellules mortes, de la viabilité et du DebrisIndex™ d’un échantillon, le tout en environ 30 secondes. Les instruments sont fabriqués à partir de composants de haute qualité qui restent stables dans le temps. Cela, combiné à des procédures d’étalonnage approfondies effectuées au moment de la fabrication, détermine une faible variation entre les différents instruments, utilisateurs et sites. Cette technologie garantit un niveau de précision optimum de votre comptage cellulaire.

Le NucleoCounter® NC-202™ avec la Via2-Cassette™, associent une précision et une exactitude à la pointe de l’industrie, ce qui vous garantit des résultats cohérents tout en protégeant les utilisateurs.