Recherche sur les cellules souches

Numération de cellules fiable pour assurer une différenciation réussie

Au cours des deux dernières décennies, les cellules souches ont attiré une attention considérable dans les secteurs universitaires et industriels. Cet intérêt est dû au fait que ces cellules présentent un potentiel pour soulager ou même guérir de nombreuses maladies. Cependant, avant qu’il soit possible de les utiliser dans des médicaments de thérapie innovante (MTI), il est nécessaire de consacrer de nombreux travaux de recherche et de développement aux technologies spécifiques à la thérapie. Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) sont dérivées de cellules souches embryonnaires (CSE) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et sont traditionnellement cultivées sur des cellules nourricières dans un environnement bidimensionnel (une boîte/un flacon de culture tissulaire). Aux fins d’un développement contrôlé d’une niche de cellules souches, les paramètres de culture ont évolué vers des conditions de plus en plus restrictives. En l’occurrence, les composants ne doivent pas contenir de sérum, voire même être exempts de xéno-contaminants, et divers revêtements plastiques ou micro-supports se sont substitués à la fixation des cellules nourricières à l’intérieur de la boîte. Un environnement soumis à des conditions strictes permet une meilleure signalisation intercellulaire et un meilleur contrôle des facteurs qui causent le type de différenciation dirigée qui vous intéresse et doivent être utilisés pour l’obtenir.

Les progrès récents réalisés dans ce domaine ont permis de passer d’une culture de cellules souches dans des anciens systèmes de culture bidimensionnelle à des systèmes tridimensionnels plus pertinents d’un point de vue physiologique. Un exemple est la culture de sphéroïdes et d’organoïdes, qui permet une signalisation et des interactions intercellulaires appropriées pendant les phases de croissance et de différenciation. Ces cultures tridimensionnelles sont très prometteuses dans les domaines de la découverte de nouveaux médicaments et de la médecine régénérative. En effet, grâce à ces cultures, les chercheurs obtiennent de meilleurs résultats lors des tests de simulation de l’impact de leurs traitements sur les tissus dans le cadre pertinent d’un point de vue physiologique/biologique plutôt qu’en réalisant des expériences portant sur leur effet sur des couches cellulaires isolées. En raison de leur pertinence d’un point de vue physiologique, les cultures d’organoïdes peuvent également permettre de réduire le recours à certaines expérimentations animales sans que cela compromette la signification scientifique des résultats obtenus.

Quel défi cela pose-t-il ?

Outre les milieux de culture, les revêtements et le niveau de pluripotence des cellules avec lesquelles vous travaillez, la densité cellulaire constitue le quatrième facteur majeur qui contribue à la réussite d’une expérience. La signalisation intercellulaire est difficile à contrôler, mais l’ensemencement des cellules à la bonne concentration peut largement contribuer à l’obtention de la différenciation dirigée d’intérêt. Par exemple, les protocoles de différenciation conçus pour les cellules de types mésodermiques et endodermiques (par exemple les cellules progénitrices pancréatiques) ont montré que de faibles densités cellulaires affectent positivement les pourcentages de cellules d’intérêt1,2. De plus, de faibles densités cellulaires présentent également l’avantage de permettre l’utilisation de concentrations de cytokines plus faibles pour obtenir le même effet, ce qui permet de réaliser des économies considérables lors de la phase de culture cellulaire.

Inversement, les protocoles de différenciation neuronale nécessitent souvent des densités cellulaires élevées, car la signalisation intercellulaire est indispensable et la densité cellulaire lors de l’initiation du protocole détermine le ratio entre les cellules neuronales et les organoïdes cérébraux3,4.

L’entretien des cultures de CSPi est généralement réalisé en faisant passer les cultures denses sur un tamis cellulaire afin d’obtenir des agrégats de cellules de taille moyenne (amas), ce qui évite d’avoir à les dissocier en cellules individuelles avant de procéder au ré-étalement. Le recours à cette technique permet d’éviter une trop grande perturbation de la niche de CSPh pendant le tamisage et la nécessité de procéder à plusieurs tamisages, ce qui pourrait entraîner une dérive génétique et une diminution de la pluripotence.

Amélioration de la numération et de l'analyse de la viabilité des cellules dans le cadre du travail sur des CSPi

Pour assurer l’uniformité et la reproductibilité de la culture de cellules souches, il est nécessaire d’avoir recours à des méthodes précises d’estimation de la concentration et de la viabilité des cellules. Le compteur de cellules automatisé NucleoCounter® NC-202™ vous permet de réaliser une large gamme de tests spécialisés pour les CSPh en suspension unicellulaire, en agrégats ou cultivées sur des micro-supports. Il est facile à utiliser, élimine les interférences humaines et les variations associées au processus de numération et ne prend que 30 secondes par opération de numération des cellules.

Si vous souhaitez combiner la numération et l’analyse de viabilité des cellules avec des colorants cellulaires personnalisés de votre choix, le NucleoCounter ®NC-3000™ est fourni équipé d’un protocole flexible offrant jusqu’à cinq canaux permettant d’analyser jusqu’à huit échantillons par lame. Le logiciel de l’appareil (NucleoView™) fournit des données d’image fluorescentes complètes, ainsi que des histogrammes avec des paramètres de fenêtrage modifiables, afin de vous offrir une maîtrise totale lors de l’analyse de vos données.

Pour obtenir de plus amples informations sur la façon dont vous pouvez améliorer votre analyse des CSPh dans le cadre des thérapies par cellules souches, veuillez consulter les pages suivantes :

Cellules souches mésenchymateuses (CSM)
Cellules souches pluripotentes induites (CSPi)
Cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Références

  1. AE Chen, M Borowiak, RI Sherwood et al.: Functional evaluation of ES cell-derived endodermal populations reveals differences between Nodal and Activin A-guided differentiation. Development. 2013; 140(3):675-86. 
  2. M Hansson, DR Olesen, JML Peterslund et al.: A late requirement for Wnt and FGF signaling during activin-induced formation of foregut endoderm from mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 2009; 330(2):286-304. 
  3. Srimasorn, M Kirsch, S Hallmeyer-Ellgner et al.: Increased Neuronal Differentiation Efficiency in High Cell Density-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Int. 2019; 2019:2018784. 
  4. MA Lancaster and JA KnoblichGeneration of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014; 9(10):2329-40.

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