Détection de l’activité des caspases 3/7, 8 ou 9

Détection de l'apoptose à l'aide du test FLICA

  • Détermine l’activité des caspases 3/7, 8 ou 9
  • Un protocole facile à utiliser avec des paramètres prédéfinis
  • Quantifie l’activité spécifique des caspases dans les cellules
  • Détermine si l’apoptose/nécrose est à un stade précoce ou tardif
  • Analyse rapide et automatisée des cellules individuelles
  • Présentation claire des données grâce à la fonction Plot Manager
  • Rapports automatisés au format PDF
  • Export des données aux formats FCS/ACS

Présentation du test d’activité des caspases

Les caspases (protéases à cystéine hydrolysant la liaison peptidique du côté carboxyle d’un résidu d’aspartate) sont des enzymes appartenant à la famille des protéases, essentielles à l’exécution de la mort cellulaire programmée. Principaux exécuteurs du processus apoptotique, lors de l’activation, les caspases provoquent l’apoptose par protéolyse de substrats spécifiques.

Notre test permet de mesurer l’activité des caspases 3/7, 8 ou 9 à l’aide d’une séquence inhibitrice spécifique à ces enzymes liée à une sonde fluorescente. La fluorescence mesurée donne ainsi une mesure directe de la quantité de caspases actives dans l’ensemble de la cellule vivante. Les cellules non-viables sont identifiées à l’aide de l’iodure de propidium (PI). Ce test est connu sous la dénomination « Dosage de l’inhibiteur marqué au fluorochrome des caspases (FLICA) ».

Principe du test

Lors de l’utilisation de notre test de l’apoptose (FLICA), l’activité des caspases est mesurée par une séquence inhibitrice spécifique de ces enzymes liée à une sonde fluorescente.

L’inhibiteur non-cytotoxique des caspases est un perméant cellulaire qui traverse la membrane plasmique intacte où il se lie de manière covalente au résidu cystéine réactif sur la grande sous-unité de l’hétérodimère caspase actif. L’inhibiteur des caspases non lié sort alors de la cellule pour être éliminé, sans déterminer aucune interférence des pro-caspases ou des formes inactives de l’enzyme. La fluorescence mesurée donne ainsi une quantification directe de la quantité de caspases actives dans l’ensemble de la cellule vivante. Les cellules non-viables sont identifiées à l’aide de l’iodure de propidium IP.

Se servant de la microscopie en fluorescence et l’analyse d’images, le système NucleoCounter® NC-3000™ automatise la détection des cellules apoptotiques en fonction de l’activité des caspases. Les cellules sont colorées au Hoechst 33342, à l’IP et un réactif FLICA marqué à la carboxyfluorescéine.

La population cellulaire totale est colorée au Hoechst 33342 (bleu), tandis que les cellules apoptotiques au stade précoce et les cellules apoptotiques/nécrotiques au stade tardif sont colorées au réactif FLICA marqué à la carboxyfluorescéine (vert) et à l’IP (rouge), respectivement.

Résultats présentés dans Plot Manager

Le diagramme montre l’effet de l’ajout de camptothécine (CPT) aux cellules Jurkat en culture. La CPT est un inhibiteur de topoisomérase couramment utilisé qui induit l’apoptose en activant ansi les caspases. Les cellules Jurkat sont une lignée cellulaire immortalisée de lymphocyte T humain, couramment utilisée pour étudier l’efficacité de potentiels composés anticancéreux.

Les cellules Jurkat ont été cultivées en l’absence (rangée supérieure) ou en présence (rangée inférieure) de camptothécine (CPT). Les cellules ont été colorées au Hoechst 33342, au réactif FLICA (FAM) et à l’IP et analysées à l’aide de l’essai du NucleoCounter® NC-3000™ des caspases 3/7, 8 ou 9. Des diagrammes de dispersion et histogrammes ont été obtenus avec le logiciel NC-3000™ NucleoView™. Les polygones et marqueurs des graphes illustrés ont été utilisés pour délimiter les différentes populations cellulaires. Dans cet exemple, la CPT provoque une augmentation significative des cellules apoptotiques au stade précoce (marquées comme positives aux caspases FAM et négatives à l’IP dans le quadrant inférieur droit du deuxième graphe).