Test du potentiel de la membrane mitochondriale

Évaluation de l'apoptose à l'aide du colorant lipophile JC-1

  • Distinguer facilement les cellules polarisées (saines), les cellules dépolarisées (apoptotiques) et les cellules apoptotiques nécrotiques/à un stade avancé
  • Analyse rapide et automatisée des cellules individuelles
  • Acquisition et analyse en une seule étape
  • Résultats standardisés – même avec différents utilisateurs
  • Aucun étalonnage requis
  • Présentation claire des données avec la fonctionnalité Plot Manager
  • Rapports automatisés au format PDF
  • Exportation des données aux formats FCS/ACS

Présentation du test du potentiel de la membrane mitochondriale

Le colorant cationique lipophile JC-1 peut être utilisé pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale. Dans les cellules saines, la charge négative résultant du potentiel de la membrane mitochondriale intacte facilite l’accumulation de JC-1 dans la matrice mitochondriale.

On sait que la perte de potentiel de la membrane mitochondriale précède l’apoptose et la nécrose induite par l’hypoxie chimique. JC-1 présente une accumulation qui dépend du potentiel dans les mitochondries et possède des propriétés à double fluorescence : La fluorescence rouge signale que le colorant a formé des agrégats, tandis que la fluorescence verte indique que le colorant est monomère. Il s’agit d’une méthode simple basée sur l’utilisation de la fluorescence pour distinguer les cellules saines (coloration en rouge) des cellules apoptotiques (coloration en vert) dans un échantillon.

Principe du test

En ayant recours à la microscopie à fluorescence et l’analyse d’image, le NucleoCounter® NC-3000™, un cytomètre en images de pointe, détecte automatiquement les cellules présentant un potentiel de la membrane mitochondriale effondré. Les cellules sont colorées à l’aide de JC-1 et de DAPI (solution 7 et solution 8, respectivement).

Les monomères et les agrégats cellulaires JC-1 sont détectés en fonction de l’intensité de fluorescence verte et rouge, respectivement. La dépolarisation mitochondriale apparaît comme une diminution du rapport entre la fluorescence rouge et verte. Les cellules nécrotiques et apoptotiques à un stade tardif sont détectées sous la forme de cellules fluorescentes bleues (c’est-à-dire positives au DAPI).

Résultats présentés dans Plot Manager

Le diagramme illustre l’effet de l’ajout de camptothécine (CPT) sur les cellules Jurkat. La CPT est un poison de la topoisomérase couramment utilisé, qui induit l’apoptose, perturbant ainsi le potentiel de la membrane mitochondriale des cellules. Les cellules Jurkat sont une lignée immortalisée de cellules lymphocytaires T humaines, auxquelles on a fréquemment recours pour étudier l’efficacité de composés anticancéreux potentiels.

Les cellules Jurkat ont été cultivées en l’absence (rangée supérieure) ou en présence (rangée inférieure) de camptothécine (CPT). Les cellules ont été colorées à l’aide de JC-1 et de DAPI, et analysées en utilisant le test du potentiel de la membrane mitochondriale. Les diagrammes de dispersion et les histogrammes ont été fournis par le logiciel NucleoView™ NC-3000™
On utilise des polygones et des marqueurs dans les tracés affichés afin de délimiter les différentes populations cellulaires. Dans cet exemple, 9 % des cellules non traitées sont dépolarisées/apoptotiques, tandis que 61 % des cellules traitées avec de la CPT sont dépolarisées/apoptotiques. Ces résultats suggèrent que la CPT a un effet important sur le potentiel de la membrane mitochondriale.